《Food Bioscience》：In Situ UDP-GlcA Generation Enables Glucuronide-Selective Multienzyme Biosynthesis and Structural Discovery of Quercetin Glucuronides
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•GlcA驱动级联实现了Q3G合成的原位UDP-GlcA供应。•槲皮素-3,7-O-二葡萄糖醛酸苷首次实现酶法合成。•M1 VvGT5产生了1162 mg/L的Q3G，槲皮素转化率达81.0%。•槲皮素葡萄糖醛酸苷表现出改善的模拟肠道保留性。引言类黄酮是植物来源的酚类次级代谢
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GlcA驱动级联实现了Q3G合成的原位UDP-GlcA供应。
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槲皮素-3,7-O-二葡萄糖醛酸苷首次实现酶法合成。
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M1 VvGT5产生了1162 mg/L的Q3G，槲皮素转化率达81.0%。
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槲皮素葡萄糖醛酸苷表现出改善的模拟肠道保留性。
引言
类黄酮是植物来源的酚类次级代谢产物中结构多样化的一类化合物，通常具有C6-C3-C6碳骨架（Shen等，2022）。基于结构差异，它们通常被分为黄酮醇、黄酮、异黄酮、花色素、黄烷酮、黄烷醇和查尔酮（S. Chen等，2023）。这些化合物广泛分布于水果、蔬菜和药用植物中，因其抗氧化、抗炎、心脏保护和代谢调节特性，在营养、功能食品和营养保健品研究中持续受到关注。近期的食品研究进一步支持了其重要性，表明富含类黄酮和酚类的植物材料，如彩色洋葱和香蕉花序，与抗氧化能力密切相关，并具有作为功能性成分的潜在价值（Vojnovi?等，2025；Sheu等，2025）。槲皮素是一种具有代表性的多羟基黄酮醇，广泛存在于多种可食用植物中，已被证明与抗氧化防御、减轻ROS驱动的肝癌发生和止咳活性相关（Batiha等，2020；Reyes-Avendano等，2022；Guo等，2023；Salehi等，2020）。然而，其固有的分子结构导致水溶性差和化学稳定性有限，从而限制了其生物利用度和食品相关应用（Zhao等，2019）。
糖基化是植物次级代谢产物的主要修饰方式，也是改善类黄酮苷元溶解度、稳定性和生物利用度的有效策略（Cai等，2013；Ji等，2020；Yang等，2023）。在糖基化过程中，苷元的一个或多个羟基与糖基共轭，生成具有显著结构和功能多样性的糖苷（Gharabli等，2024）。大多数天然存在的类黄酮糖苷含有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或木糖，而含有葡萄糖醛酸（GlcA）的糖苷则较少见（Di Stefano等，2012）。然而，含有GlcA的代谢物可以表现出显著的生物活性。例如，吗啡-6-葡萄糖醛酸苷的镇痛活性强于吗啡本身（Mikus & Klimas，2015）。类似的活性增强效应也在纳布啡中得到报道，纳布啡是一种半合成镇痛药，其效力低于吗啡，其葡萄糖醛酸化代谢物纳布啡-6-葡萄糖醛酸苷的镇痛效果优于母体化合物（Y.-L. Chen等，2024）。
槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（Q3G），又称米菊素，是槲皮素的主要代谢物和天然存在的葡萄糖醛酸化黄酮醇衍生物。由于据报道具有抗炎、抗氧化、代谢调节和神经保护活性，Q3G引起了越来越多的关注（Derlindati等，2012；Kim等，2021；Wang等，2023）。近期的研究进一步将Q3G与褐色和米色脂肪细胞表型及能量代谢相关通路联系起来，提示其在营养干预和功能食品开发中的潜在相关性（Wang等，2023）。然而，Q3G在天然来源中含量相对较低，直接从植物中提取受到原料变异性、产量低和纯化复杂等限制。化学合成可以提供糖苷，但通常需要保护-脱保护步骤，且可能受区域选择性和环境负担的限制（Chaves等，2020）。这些局限性凸显了对Q3G及相关槲皮素葡萄糖醛酸苷进行高效、区域选择性生物合成路线的需求。
酶法合成提供了一种温和且具有区域选择性的策略来生产类黄酮糖苷。例如，UDP依赖性糖基转移酶已被用于以UDP-葡萄糖（UDP-Glc）为糖供体从槲皮素合成槲皮素葡萄糖苷。与糖基化相比，酶法葡萄糖醛酸化需要UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA），这是一种成本较高的活化糖供体，在制备性糖基转移酶反应中较少被采用。植物葡萄糖醛酸糖基转移酶可以利用UDP-GlcA生成类黄酮O-葡萄糖醛酸苷，包括槲皮素葡萄糖醛酸苷（Yue等，2019）。然而，规模化生产仍受到UDP-GlcA供应、酶活性和产物选择性的限制。因此，一种将糖供体形成与槲皮素葡萄糖醛酸化直接偶联的原位UDP-GlcA生成级联可以提供一条制备Q3G和结构相关葡萄糖醛酸苷的有效路线。
然而，酶法合成Q3G的实际应用仍受到UDP-GlcA高成本的限制。为减少对外源UDP-GlcA的依赖，Du等人开发了一种基于蔗糖的UDP-GlcA生物合成系统，使用两个质粒pACYCDuet-Pgm-GalU和pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA（Du等，2024）。在该系统中，UDP-GlcA通过UDP-Glc生成。尽管该策略降低了生产成本，但积累的UDP-Glc可能与受体底物反应生成不需要的糖基化副产物。因此，这种依赖中间体的路线可能损害产物特异性和UDP-GlcA产量，凸显了对避免UDP-Glc积累的替代UDP-GlcA供应策略的需求。
在本研究中，我们开发了一种三酶级联，通过原位UDP-GlcA生成从槲皮素和GlcA生物合成Q3G。该级联将VvGT5（一种由Ono等（2010）先前表征的UDP-GlcA：黄酮醇-3-O-葡萄糖醛酸糖基转移酶）与AtGlcAK（一种将GlcA磷酸化的葡萄糖醛酸激酶）和AtUSP（一种将GlcA衍生的葡萄糖醛酸-1-磷酸和UTP转化为UDP-GlcA的UDP-糖焦磷酸化酶）相结合。以ATP和UTP作为辅因子供应，该级联将UDP-GlcA形成直接与VvGT5催化的槲皮素3-O-葡萄糖醛酸化偶联在单一反应系统中。该设计避免了直接补充UDP-GlcA，并有利于葡萄糖醛酸苷形成而非糖基化。除了Q3G生产外，我们还研究了级联中二葡萄糖醛酸化槲皮素产物的形成。为改善VvGT5用于级联生物转化的适用性，我们进一步将序列和表达优化与AiCE引导的诱变相结合，以提高可溶性表达、表观活性和热稳定性。
节段摘要
材料与菌株
除另有说明外，所有商业购买试剂均为分析纯。槲皮素、UDP-GlcA、ATP、UTP和Q3G购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。QuickCut DpnI和PrimeSTAR Max DNA聚合酶购自北京鼎国生物技术有限公司（中国北京）。酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠、氨苄青霉素（Amp）、新霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自赛恩生物
人工多酶级联的构建用于槲皮素葡萄糖醛酸化
酶法槲皮素葡萄糖醛酸化的主要挑战在于选择性形成葡萄糖醛酸苷产物而不依赖外源供应的UDP-GlcA。UDP-GlcA价格昂贵，限制了其在制备性糖基转移酶催化反应中的应用（Muthana等，2015；Jia等，2025）。因此，我们设计了一种GlcA驱动的三酶级联，在原位生成UDP-GlcA并将供体形成与槲皮素葡萄糖醛酸化直接偶联。在该系统中，AtGlcAK将
结论
在本研究中，我们开发了一种葡萄糖醛酸驱动的多酶级联，用于高效生物合成槲皮素葡萄糖醛酸苷。通过将AtGlcAK和AtUSP介导的原位UDP-GlcA生成与VvGT5催化的葡萄糖醛酸化偶联，该系统避免了直接补充UDP-GlcA，并实现了从槲皮素和GlcA生产Q3G。由于ATP和UTP仍以化学计量供应，该级联应被视为一种原位UDP-GlcA供应策略，而非完全
CRediT作者贡献声明
何志勇：可视化、资源、资金支持获取。陈杰：资源、项目管理。曾毛毛：资源。王昭军：资源。陈秋明：监督、资源。陈世康：撰写-原稿。李文军杰：撰写-原稿、方法论、调查、资金支持获取、形式化分析、数据管理、概念化
未引用参考文献
Carbonell-Capella等，2014；Chen等，2024；Gharabli和Welner，2024；Henzler-Wildman和Kern，2007；Hollingsworth和Dror，2018；Ren等，2023。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究由国家重点研发计划（项目编号：2022YFF1100204）资助。
李文军杰|陈世康|陈秋明|王昭军|曾毛毛|陈杰|何志勇
