逐步工程改造解脂耶氏酵母以实现风味倍半萜β-石竹烯的微生物生产

《Food Bioscience》：Stepwise Engineering of Yarrowia lipolytica for Microbial Production of the Flavor Sesquiterpene β-Caryophyllene

　　**亮点**- QHS1在产油假丝酵母中β-石竹烯的生产表现优于TPS7。- ERG9下调减少了甾醇生物合成对FPP的竞争。- IU融合和异戊烯醇投加改善了前体供给。- 22 °C培养进一步提高了β-石竹烯产量。- 最终菌株在摇瓶培养中产量达465.9 mg/L。## 引言β-石竹烯是一种双环倍半萜，存在于肉桂和丁香等植物中。在植物中，它参与生长和防御相关过程，并对与病原体和食草动物的互作有贡献。它具有特征性的丁香样香气，已获得美国食品药品监督管理局批准作为调味剂和辅助剂使用，支持其在食品和化妆品行业的应用。β-石竹烯还因其报道的抗菌、镇痛、抗炎和抗肿瘤相关活性而受到关注。这些特性促使研究人员开发更高效的生产途径。目前，β-石竹烯主要通过植物提取或化学合成获得。然而，植物提取受气候、种植时间和原料变异性等因素限制，难以实现可规模化且稳定的供应。化学合成也面临路线复杂性和生产效率方面的挑战。微生物生物合成提供了一种可控的替代方案来生产萜类化合物和其他高附加值天然产物，尤其是当途径酶和前体供应能够被系统优化时。β-石竹烯的生物合成起始于乙酰辅酶A，通过甲羟戊酸或甲基赤藓糖醇磷酸途径生成法尼基焦磷酸，随后由β-石竹烯合酶将其转化为β-石竹烯。产油假丝酵母是该途径的理想底盘，因为它具有内源性的MVA途径、强乙酰辅酶A代谢能力和良好的异源表达能力。这些特征使其已被用于多种萜类化合物的生物合成，包括α-法尼烯、柠檬烯、长白龙脑烯和白藜芦醇等。此外，产油假丝酵母已被广泛用于食品和医药应用，使其成为工程化倍半萜合成的理想底盘。微生物β-石竹烯生产已在细菌和酵母宿主中通过互补的宿主特异性工程策略进行了研究。在大肠杆菌中，筛选烟草来源的合酶TPS7并进行下游MVA途径基因染色体整合，实现了摇瓶滴度100.3 mg/L。在酿酒酵母中，筛选β-石竹烯合酶、ERG20与AarTPS88融合以及加强MVA途径调控，将摇瓶滴度提高至828.4 mg/L。最近，协同调控甾醇和脂肪酸合成，并结合葡萄糖感知途径的工程化，在摇瓶条件下将酿酒酵母中β-石竹烯产量提高至1.25 g/L。在产油假丝酵母中，启动子工程化和QHS1与tHMG1的多拷贝表达在摇瓶培养中实现了318.5 mg/L的产量。综上所述，这些研究表明高效的β-石竹烯生产需要终末合酶活性、前体可用性和竞争性内源途径的协同调控。然而，在产油假丝酵母中尚未系统评估终末合酶工程化、受控FPP再分配和正交异戊烯醇利用途径的组合应用。在本研究中，我们首先比较了两种β-石竹烯合酶，并选择表现更优的酶进行半理性工程化。随后，我们评估了乙酰辅酶A和NADPH供给模块、通过ERG9调控的FPP再分配、用于额外提供IPP/DMAPP的异戊烯醇利用途径以及培养条件。这一分步策略将工程化范围扩展至启动子和拷贝数优化之外，并确定了产油假丝酵母中β-石竹烯生产的互补性酶学、代谢和工艺层面的干预点。## 章节摘要### 菌株与质粒构建大肠杆菌DH5α用于质粒构建。产油假丝酵母po1f作为底盘菌株用于构建工程化菌株。本研究使用的外源基因包括来自黄花蒿的β-石竹烯合酶基因、来自烟草的β-石竹烯合酶基因、来自拟南芥的异戊烯基磷酸激酶基因以及来自变异链球菌的二酰甘油激酶。所有外源基因均针对表达进行了密码子优化。### β-石竹烯合酶的筛选与途径构建FPP是倍半萜生物合成的直接前体。在本研究中，β-石竹烯滴度作为主要评价指标，用于评估不同工程化策略是否改善了FPP的有效供给以及上游IPP/DMAPP池。在产油假丝酵母中，β-石竹烯由FPP经β-石竹烯合酶的作用生成。先前的研究已鉴定出两种能够催化该反应的酶，即来自烟草的TPS7和...### 结论本研究通过依次优化终末合酶性能、FPP分配、辅助IPP/DMAPP供给和培养条件，提高了产油假丝酵母中微生物β-石竹烯的生产。QHS1优化、ERG9下调和IU途径构建各自在工程菌株背景下对产量提升作出了贡献，而所测试的NADPH供给模块未提供额外益处。在测试的异戊烯醇投加水平中选择最优水平...### CRediT作者贡献声明**张小：** 初稿撰写、形式分析、数据整理。**姚一统：** 调查研究、形式分析。**王嘉旭：** 调查研究。**张雨和：** 调查研究。**李大伟：** 可视化。**郑丹琳：** 可视化。**李红叶：** 指导、资源提供、资助获取。**邹理工：** 审稿与编辑、指导、资助获取、概念构思。### 未引用参考文献Kanchana Rueksomtawin等人，2017年；Zhang等人，2022年。### 声明作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文所报告的工作。## 利益冲突声明? 作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文所报告的工作。## 致谢本研究受以下资助支持：教育部基础学科与交叉学科突破计划；国家自然科学基金；广州市重点研发计划；博士后科学基金资助计划。