《Food Chemistry: X》：Preparation of phycocyanin-rich powder from
Spirulina platensis algae using freeze/thaw/osmotic treatment coupled with Refractance Window drying and its application as a colorant in set-type yoghurt
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藻蓝蛋白（Phycocyanin，PC）是蓝藻中一种蓝色的藻胆蛋白，在藻胆体内充当捕光色素。它是一种水溶性、无毒蛋白质，由α和β多肽亚基组装为单体、三聚体（αβ）?和六聚体[（αβ）?]?。每个单体携带一个或两个藻蓝胆素发色团（phycocyan
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藻蓝蛋白（Phycocyanin，PC）是蓝藻中一种蓝色的藻胆蛋白，在藻胆体内充当捕光色素。它是一种水溶性、无毒蛋白质，由α和β多肽亚基组装为单体、三聚体（αβ）?和六聚体[（αβ）?]?。每个单体携带一个或两个藻蓝胆素发色团（phycocyanobilin chromophore），这是一种通过硫醚键共价连接的开链四吡咯化合物，赋予该色素强烈的蓝色及其在620 nm附近的吸收峰，其中A???/A???比值常用于评估提取物纯度（高于0.7即视为食品级）。钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）生物质通常含有14–25%的藻蓝蛋白（以干重计），使其成为该色素的主要商业来源。除作为天然着色剂外，藻蓝蛋白还表现出强效的抗氧化、抗炎、神经保护和抗癌活性，后者已通过其抑制胰腺癌、乳腺癌和非小细胞肺癌细胞系增殖并诱导凋亡的能力得到证实。这些综合特性，加上其作为食品用安全物质的监管地位，推动了食品、化妆品和制药领域对藻蓝蛋白日益增长的兴趣，全球市场预计将在未来十年大幅扩张。
研究人员采用冻融细胞破碎法从钝顶螺旋藻生物质中提取藻蓝蛋白，以100 mM NaCl溶液作为提取溶剂，生物质与溶剂比为1:80（g/mL），在?18 °C冷冻24 h后室温解冻，冻融循环重复1至14次。通过紫外-可见分光光度法测定藻蓝蛋白含量和纯度，并评估了提取物的颜色属性。在粉末制备阶段，采用折射窗（Refractance Window，RW）干燥技术在不同温度下对藻蓝蛋白提取物进行干燥，评估干燥温度对粉末理化性质和色素稳定性的影响。在应用阶段，将不同RW干燥温度下获得的三组藻蓝蛋白粉掺入凝固型酸奶配方中，评估其在发酵和储存期间对产品理化、结构及品质属性的影响。
研究结果表明，NaCl辅助冻融处理显著提高了藻蓝蛋白的得率和纯度，12次冻融循环结合NaCl处理使藻蓝蛋白回收率最大化。在70 °C下进行折射窗干燥最能保持藻蓝蛋白含量。别藻蓝蛋白（Allophycocyanin，APC）和藻红蛋白（Phycoerythrin，PE）在高温下比藻蓝蛋白更稳定。采用70 °C干燥粉末制备的酸奶表现出最强的颜色，但脱水收缩（syneresis）也最高。
论文解读文章
一、研究背景与问题提出
藻蓝蛋白（Phycocyanin，PC）是一种蓝色藻胆蛋白，主要存在于蓝藻尤其是钝顶螺旋藻（Arthrospira platensis，俗称螺旋藻）中，在藻胆体内充当捕光色素。该蛋白为水溶性、无毒蛋白质，由α和β多肽亚基组装为单体、三聚体和六聚体结构，每个单体携带一个或两个藻蓝胆素发色团，赋予色素强烈的蓝色并在620 nm附近产生吸收峰。A???/A???比值是评估提取物纯度的常用指标，高于0.7即视为食品级。螺旋藻生物质通常含14–25%的藻蓝蛋白（干重计），是该色素的主要商业来源。除作为天然着色剂外，藻蓝蛋白还表现出抗氧化、抗炎、神经保护和抗癌等生物活性，加上其食品安全的监管地位，推动了其在食品、化妆品和制药领域的广泛应用，全球市场预计在未来十年显著扩张。
藻蓝蛋白的提取方法包括色谱分离、超声辅助提取和冻融细胞破碎等。其中冻融法因操作简单、可规模化且避免有毒溶剂而被广泛采用。提取效率取决于循环次数、缓冲液或溶剂类型以及物种特异性细胞壁特征，通常报道3至5次循环为得率和纯度的最佳条件。缓冲液选择对提取性能影响显著，磷酸钠缓冲液可提高得率和纯度，而Tris-HCl缓冲液在其他物种中倾向于获得更高藻蓝蛋白浓度。盐的添加，尤其是NaCl，通过维持离子强度、促进细胞膜渗透压休克以及减少叶绿素和其他杂质的共提取来改善提取物纯度。由于藻蓝蛋白对热、光和长时间加工高度敏感，且干生物质比新鲜材料更难破碎，因此必须仔细优化循环次数、温度和盐浓度，以在保持色素完整性的同时最大化得率。
提取后的藻蓝蛋白溶液需转化为稳定粉末以便处理、储存和掺入食品基质，通常通过干燥或微胶囊化工艺保护色素免受氧化、热和水分相关的降解。传统方法如烘箱干燥和对流干燥虽然简单但能耗高、耗时长。冷冻干燥虽然有效但成本高、能耗大。微波、对流红外和折射窗（Refractance Window，RW）干燥等非传统技术因其效率和优异的生物活性化合物及颜色保留能力而受到关注。RW干燥中，薄层产品铺在漂浮于循环热水上的透明塑料膜上，热量通过膜的传导、水的对流以及膜的折射率接近水时的辐射传递，蒸发冷却使产品温度比水温低20–25 °C。RW干燥在大气压和低于80 °C下运行，能效高、成本低，色素保留可与冷冻干燥媲美，是加工螺旋藻生物质的工业可行方案。对于螺旋藻，在约70 °C下干燥4.5 h可获得水分含量低于10%且酚类、黄酮类和藻蓝蛋白保留良好的产品，而更高温度或延长干燥时间会加速色素降解。
所得藻蓝蛋白粉作为天然着色剂和功能性添加剂在乳制品中具有广阔前景，尤其是发酵产品如酸奶，因其消费广泛且含有活性乳酸菌而成为理想基质。低脂酸奶中添加藻蓝蛋白已被证明可增强抗氧化活性并赋予抗菌效果，减少腐败菌而不损害乳酸菌生长。粉末在该场景中的表现很大程度上取决于上游提取和干燥条件所决定的粒径、水分含量和色素浓度，以及藻蓝蛋白对酸奶酸性发酵环境的敏感性。
尽管冻融提取、RW干燥和天然色素强化乳制品各自已有研究，但将其整合为单一工艺用于生产富藻蓝蛋白粉末并直接应用于天然乳制品着色剂的研究鲜有报道。具体而言，将多次冻融循环与NaCl辅助渗透处理相结合以共同最大化螺旋藻藻蓝蛋白得率和纯度的研究有限；螺旋藻生物质干燥研究主要依赖冷冻干燥或常规热风干燥，评估RW干燥温度对色素保留和粉末性质影响的研究很少；虽然螺旋藻粉已在不同阶段添加到酸奶中，但系统评估RW干燥富藻蓝蛋白粉作为天然着色剂以及提取、干燥条件、粉末特性与酸奶品质之间关系的研究仍然缺乏。填补这一空白对于建立适合乳制品应用的藻蓝蛋白粉的集成化、工业可扩展工艺至关重要。该研究的创新之处在于将绿色NaCl辅助冻融提取工艺、折射窗干燥技术以及所得富藻蓝蛋白粉在凝固型酸奶中的应用整合到单一加工框架中。
二、研究内容与主要结论
该研究围绕三个目标展开：第一，在提取阶段，研究冻融处理结合NaCl辅助渗透处理在多次提取循环中对螺旋藻生物质藻蓝蛋白得率和品质的影响；第二，在粉末生产阶段，采用折射窗方法在不同温度下干燥藻蓝蛋白提取物，评估对所得粉末理化性质和色素稳定性的影响；第三，在应用阶段，将不同RW干燥温度下获得的三组藻蓝蛋白粉掺入凝固型酸奶配方中，评估其在发酵和储存期间对产品理化、结构和品质属性的影响。
研究结果表明，NaCl辅助冻融处理显著提高了藻蓝蛋白的得率和纯度，12次冻融循环结合NaCl处理使藻蓝蛋白回收率最大化。在70 °C下进行折射窗干燥最能保持藻蓝蛋白含量。别藻蓝蛋白和藻红蛋白在高温下比藻蓝蛋白更稳定。采用70 °C干燥粉末制备的酸奶表现出最强的颜色，但脱水收缩也最高。
三、关键技术与方法
研究人员采用的主要关键技术方法包括：冻融细胞破碎提取法，将干燥藻类生物质悬浮于蒸馏水或100 mM NaCl溶液中（生物质与溶剂比1:80 g/mL），在?18 °C冷冻24 h后室温解冻，循环1至14次，离心收集上清液作为粗藻蓝蛋白提取物；紫外-可见分光光度法（UV-Vis spectrophotometry），在200–800 nm范围记录提取物吸收光谱，并在相应波长测定藻胆蛋白浓度，按Bennett和Bogorad方法计算藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蛋白含量；手持色度计测定Hunter颜色参数L、a、b，计算色度（C）、色相角（h°）和总色差（ΔE）；折射窗干燥技术，在不同温度下将藻蓝蛋白提取物干燥为粉末；SDS-PAGE蛋白质电泳分析。样本来源为越南Vinh Hao Algae Joint Stock Company提供的冷冻干燥钝顶螺旋藻生物质。
四、研究结果
4.1 提取阶段：冻融循环次数与NaCl对藻蓝蛋白得率和纯度的影响
研究人员将冻融循环次数从1次扩展到14次，结合100 mM NaCl渗透处理，系统评估了提取曲线。结果表明，随着循环次数增加，藻蓝蛋白得率持续上升，12次循环时达到最大化回收。NaCl的添加通过维持离子强度和促进渗透压休克，减少了叶绿素等杂质的共提取，从而提高了提取物纯度。超过12次循环后，进一步增加循环次数对藻蓝蛋白回收的改善有限。
4.2 粉末生产阶段：RW干燥温度对粉末理化性质和色素稳定性的影响
研究人员采用折射窗干燥技术在不同温度下处理藻蓝蛋白提取物。结果显示，70 °C是最佳干燥温度，在此条件下藻蓝蛋白含量保留最好。比较不同藻胆蛋白的热稳定性发现，别藻蓝蛋白和藻红蛋白在高温下比藻蓝蛋白更稳定，表明藻蓝蛋白对热最为敏感。干燥温度对粉末的理化性质如水分含量、色素浓度和颜色属性均有显著影响。
4.3 应用阶段：不同RW干燥温度粉末对凝固型酸奶品质的影响
研究人员将三组不同RW干燥温度下获得的藻蓝蛋白粉分别掺入凝固型酸奶中，评估其对产品理化、结构和品质属性的影响。结果表明，采用70 °C干燥粉末制备的酸奶表现出最强的蓝色着色效果，但该组酸奶的脱水收缩率也最高，说明色素添加与酸奶凝胶结构之间存在相互作用，可能影响产品的质地稳定性。
五、讨论与结论
讨论部分指出，NaCl辅助冻融处理结合多次循环能够有效提高藻蓝蛋白的提取效率，这归因于冰晶形成对细胞壁的机械破碎与盐渗透压的协同作用。折射窗干燥在70 °C下表现出优异的色素保留能力，其机制在于蒸发冷却使产品温度显著低于水温，减轻了热降解。不同藻胆蛋白热稳定性的差异提示在工艺设计中需针对藻蓝蛋白的特殊敏感性采取保护措施。在酸奶应用中，藻蓝蛋白粉的添加赋予产品天然蓝色，但同时也影响了酸奶的凝胶网络结构，导致脱水收缩增加，这需要在配方设计中加以平衡。
研究结论部分指出，该研究成功建立了一个集成的、工业可扩展的工艺路线：通过NaCl辅助冻融提取（12次循环）获得高得率和高纯度的藻蓝蛋白提取物，经70 °C折射窗干燥制备出色素保留良好的富藻蓝蛋白粉末，该粉末可作为天然蓝色着色剂应用于凝固型酸奶。尽管70 °C干燥粉末赋予酸奶最强的颜色，但伴随的脱水收缩增加提示在实际应用中需优化添加量或结合其他稳定剂以改善产品品质。该研究为螺旋藻藻蓝蛋白从提取、干燥到乳制品应用的全链条开发提供了系统的技术参考。
