六分钟近UPLC性能的HPLC法测定黑加仑花青素：415个基因型筛选

《Food Chemistry》：A six-minute HPLC with near UPLC performance for the determination of anthocyanins in black currant: Screening of 415 genotypes

　　

研究人员建立并验证了一种超快速反相高效液相色谱-二极管阵列检测（RP-HPLC-DAD）方法，采用Kinetex EVO C₁₈色谱柱，在6 min内实现黑加仑（Ribes nigrum L.）中11种花青素的近超高效液相色谱（UPLC）性能分离，四种主要花青素及矮牵牛素3-O-芸香糖苷（petunidin 3-O-rutinoside）均达到基线分离（分辨率Rs≥1.5）。该方法运行压力相对较低（9–11 MPa），经超过2500次黑加仑样品进样验证，保留时间相对标准偏差（RSD）小于1%，系统背压增幅仅0.4–0.5 MPa，且仅需一支保护柱。将该高通量流程应用于415个黑加仑种间杂交基因型筛查，结果显示花青素谱以飞燕草素3-O-芸香糖苷（44%）和矢车菊素3-O-芸香糖苷（33%）为主；矮牵牛素3-O-芸香糖苷在16个基因型中含量可观，尤其在‘Ores × Ijunskaya Kondrashovoi’谱系中平均含量为10 mg 100 g^?1鲜重（FW），高于全部415个基因型的平均值4 mg 100 g^?1 FW。该方法在显著缩短分析时间的同时保持高分辨率和高灵敏度，为黑加仑种质资源的大规模花青素表型筛选及育种提供了高效、环保的分析工具。

黑加仑（Ribes nigrum L.）是欧洲重要的浆果作物，因富含花青素和维生素C而被视为“超级水果”。现代黑加仑育种越来越依赖种间杂交，以引入抗病性、产量和品质相关性状。然而，已有花青素研究大多集中于少量基因型，且常忽略次要花青素；分析时间也较长，难以满足大规模种质筛选和现代育种高通量表型鉴定的需求。为此，研究人员在《Food Chemistry》发表研究，旨在开发一种快速、高分辨率、低运行压力的高效液相色谱方法，并应用于415个黑加仑种间杂交基因型的花青素系统筛查，以解析其花青素组成多样性。

主要方法：采用反相高效液相色谱-二极管阵列检测（RP-HPLC-DAD），使用Kinetex EVO C₁₈色谱柱，6 min梯度洗脱，进样2 μL，检测波长520 nm；样品以50%乙醇（含0.36 N HCl）超声提取。基于线性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、重复性/再现性进行方法验证。415个基因型（采自拉脱维亚园艺研究所，2025年7–8月）各设6次重复，共2490次进样；次要花青素经高分辨质谱（HRMS）和三重四极杆质谱（TQ-MS）鉴定。数据用皮尔逊/斯皮尔曼相关和主成分分析（PCA）处理。

3.1 Separation optimization and validation（分离优化与验证）
研究人员在前期11 min和10 min方法基础上，仅调整梯度程序，实现了6 min内对四种主要花青素和矮牵牛素3-O-芸香糖苷的基线分离（Rs≥1.5），较此前最快方法缩短40%分析时间。峰宽仅0.10–0.15 min，接近UPLC性能；LOD为0.096–0.146 ng，LOQ为0.318–0.481 ng；连续9天保留时间%RSD为0.36–0.57。整个运行过程系统压力仅为9–11 MPa，较前期方法低2–4 MPa。在超过2500次进样后，色谱柱仍保持稳定，保留时间漂移小于1%，仅需一支保护柱，背压增幅仅0.4–0.5 MPa。研究还发现进样体积是关键参数，≤5 μL可保持峰形，2 μL为最优进样量，因提取液中50%乙醇与初始流动相存在溶剂失配效应。

3.2 Anthocyanin profile and diversity across 415 black currant genotypes（415个黑加仑基因型的花青素谱与多样性）
该研究在原有4种主要花青素和5种次要花青素基础上，新鉴定出锦葵素3-O-芸香糖苷（malvidin 3-O-rutinoside），共检测到4种主要和6种次要花青素。整体花青素构成高度一致：飞燕草素3-O-芸香糖苷占44%，矢车菊素3-O-芸香糖苷占33%，对应的葡萄糖苷分别占13%和6%，所有芸香糖苷化花青素合计约占总量的80%。总花青素含量范围为96.50–847.59 mg 100 g^?1 FW，基因型间差异约9倍。矮牵牛素3-O-芸香糖苷在R. dikuscha中含量突出，并在‘Ores × Ijunskaya Kondrashovoi’谱系中明显富集；该谱系的16个基因型平均含量为10 mg 100 g^?1 FW，而全部415个基因型总体均值为4 mg 100 g^?1 FW。

3.3 Relationships between anthocyanin content, taste, and agronomical factors（花青素含量、口感与农艺性状之间的关系）
相关分析显示，不同花