对猪空肠刷状缘膜囊泡与大鼠小肠粉的比较评估，以研究（多）酚羟基解及生物可及性

《Food Research International》：A comparative assessment of brush border membrane vesicles from porcine jejunum and small intestine powders from rat to study (poly)phenol hydrolysis and bioaccessibility

　　

• 制备了刷状缘膜囊泡（BBMV）和大鼠小肠提取物（RSIE）。
• 多酚（PP）在有或无 BBMV 或 RSIE 的情况下进行了模拟消化。
• RSIE 通过残留的宿主/微生物酶从多种糖苷结合物中形成苷元。
• RSIE 表现出非催化相互作用，非特异性地降低了 PP 的生物可及性。
• BBMV 减少了非催化相互作用，并提供了 β-O-糖苷酶特异性。

**引言**

膳食（多）酚是饮食中存在的最结构多样的植物化学物质类别之一，广泛存在于水果、蔬菜、可可、茶和咖啡等植物性食品和饮料中 (Neveu et al., 2010; Ran et al., 2024; Rasouli et al., 2017)。由于这些化合物具有调节氧化应激以及预防慢性疾病的作用，它们引起了极大的兴趣 (Cilla et al., 2022; W. Li et al., 2023)。在植物中，（多）酚主要以糖苷结合物的形式存在，O-糖苷是最常见的形式，特别是在类黄酮（如黄酮醇、黄酮、黄烷酮和花青素）中 (de Araújo et al., 2021; Gallego-Lobillo et al., 2025; Lopez-Rodulfo et al., 2024; Lopez-Rodulfo, Gallego-Lobillo, & Martinez, 2025)。在这些化合物中，糖基通过 α- 或 β-O-糖苷键连接到酚羟基上。尽管 O-糖苷是占绝对优势的类别，但自然界中还存在其他类型的（多）酚 - 糖结合物。这些包括酯键结合物，特别是在羟基肉桂酸和羟基苯甲酸（分别为 HCAs 和 HBAs）中，酚酸中的羧基部分与糖中的羟基形成酯键 (Lopez-Rodulfo, Gallego-Lobillo, & Martinez, 2025)。（多）酚与糖的结合影响其化学稳定性 (Xiao, 2022)、溶解度 (Lee et al., 2023)、生物可及性 (Gallego-Lobillo et al., 2025; Lopez-Rodulfo, Gallego-Lobillo, & Martinez, 2025)、细胞运输 (Gee et al., 2000) 以及进食或饮料摄入后对糖吸收的调节 (Iametti et al., 2022; Williamson, 2022)。例如，据报道，糖基裂解后产生的苷元是最具生物活性的形式 (Bertelli et al., 2021; Ferreira et al., 2026; Sak, 2023)。

糖苷结合（多）酚通常逃脱管腔消化酶的 hydrolysis。一个例外似乎是 HCAs 的葡萄糖酯，其羧酸酯键最近被证明易受胰腺脂肪酶介导的水解 (Lopez-Rodulfo, Gallego-Lobillo, & Martinez, 2025)。相比之下，类黄酮苷中占主导地位的 O-糖苷键通常能抵抗管腔消化，易受肠刷状缘酶裂解。特别是，（多）酚 β-O-糖苷由哺乳动物 β-糖苷酶处理，这些酶对 β-O-糖苷键具有特异性，位于小肠刷状缘的管腔侧，可在吸收前作用于膳食糖苷 (Day et al., 2000)。人体肠黏膜还表达几种 α-糖苷酶，能够 hydrolyze α-O-糖苷键，从而在 α-糖基化（多）酚的消化中发挥关键作用 (Gallego-Lobillo et al., 2025; Hooton et al., 2015; Tanaka et al., 2016)：麦芽糖酶 - 糖化酶 (MGA) 和蔗糖酶 - 异麦芽糖酶 (SI) 酶复合物。除了宿主介导的水解外，糖苷结合（多）酚还可以被肠道微生物群代谢，肠道微生物群拥有广泛的酶库，包括例如 α-L-鼠李糖苷酶和 β-D-葡萄糖苷酶，能够催化宿主无法进行的生物转化。微生物去除糖基通常是后续分解代谢反应的前提，这些反应导致低分子量代谢物的形成 (Bechtner et al., 2025; Williamson et al., 2018; Williamson & Clifford, 2010)。

尽管刷状缘酶介导的酚类水解具有功能和生物活性意义，但在体外消化模型中这一过程往往被忽视，导致对膳食（多）酚胃肠道命运的不准确表征。为解决这一局限性，大鼠小肠提取物 (RSIE) 最近被研究作为一种经济实惠的哺乳动物水解酶来源 (Gallego-Lobillo et al., 2025)。结果表明，RSIE 成功水解了苹果中的糖苷和酯键（多）酚糖苷结合物，产生了大量的苷元形式，并证实了对膳食（多）酚糖苷结合物具有 α-和 β-葡萄糖苷酶以及酯酶活性 (Gallego-Lobillo et al., 2025)。然而，苷元的形成并未成比例地反映生物可及糖苷结合衍生物的减少，表明这种复杂且未精制的生物提取物诱导了（多）酚的非特异性相互作用和物理捕获，可能扭曲了其真正的生物可及性 (Fernández-Jalao et al., 2020; Jakobek et al., 2021)。此外，RSIE 制剂的非特异性和无法区分 β-葡萄糖苷酶亚型，使得与小肠粉末相关的残留微生物酶可能对观察到的脱糖基活性做出贡献成为可能。这种混杂因素使将（多）酚水解 exclusively 归因于刷状缘酶变得复杂，并阻碍了对该过程的详细机制理解。

作为一种更具控制力的替代方案，Mamone 和 Picariello (2023) 开发并优化了一种从猪空肠分离刷状缘膜囊泡 (BBMV) 的稳健方法，提供了高度富集的肠黏膜水解酶来源。由于其定义明确的酶组成，BBMV 已成为在受控和生理相关条件下模拟肠阶段的有前途的工具，同时最大限度地减少基质相关干扰 (Di Stasio et al., 2024; Picariello et al., 2015)。迄今为止，BBMV 已被广泛用于研究肠道蛋白消化，其中氨基肽酶 N 连同其他刷状缘肽酶在从乳制品、豆类和坚果等来源的膳食蛋白中生成游离氨基酸和小肽方面发挥关键作用 (Claude et al., 2019; Di Stasio et al., 2020; Dupont & Tomé, 2019; Martineau-C?té et al., 2024; Nitride et al., 2022; Vivanco-Maroto et al., 2022)。在较小程度上，BBMV 也被应用于研究碳水化合物消化，证明了其选择性水解膳食碳水化合物和低聚糖的能力 (Ferreira-Lazarte et al., 2019; Julio-González et al., 2020)。然而，它们在植物化学物质消化研究中的应用，特别是糖苷结合（多）酚的消化，仍很大程度上未被探索。在这种情况下，我们假设 BBMV 构成了一种比 RSIE 制剂更明确的黏膜（多）酚水解酶来源，几乎不含基质衍生干扰和残留微生物水解酶。因此，BBMV 可能为在体外研究常见膳食糖苷结合（多）酚的生物可及性和水解提供一个更具生理相关性和机制信息量的系统。

本研究的目的是制备和表征从猪空肠分离的刷状缘膜囊泡 (BBMV)，并评估其在标准化体外消化模型中研究植物源酚类化合物的生物可及性和水解的适用性，以市售的大鼠小肠提取物 (RSIE) 作为参考系统。为实现此目标，从猪空肠中分离和纯化刷状缘膜囊泡，并表征其碳水化合物水解活性。来自整个苹果的酚类提取物（代表常见的膳食酚类化合物概况）被剖析并通过将上部胃肠道 INFOGEST 2.0 方案（包括黏膜酶系统（BBMV 或 RSIE））与跨上皮吸收的物理模拟相结合进行模拟消化，并通过 UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS 进行全面分析。为确保生理相关性，两种来源的酶活性被标准化为人上皮中报告的 15 U*mL?1 的麦芽糖酶活性 (Amiri & Naim, 2017)。

**章节片段**

**材料与化学品**

Jonagold 苹果（Malus domestica var. Jonagold）散装购自 ?rskov Frugt?（丹麦），于 2023 年 7 月采收。以下试剂购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）：麦芽糖、乳糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、大鼠肠酮粉（RSIE）、猪胆汁混合物、猪胰酶和猪胃蛋白酶（≥250 U/mg 固体），以及用于消化缓冲液的化学品（氯化钙、碳酸氢钠、氯化镁

**刷状缘酶系统的碳水化合物水解活性**

为了建立两种哺乳动物刷状缘酶系统之间的受控比较并优化其在消化环境中的浓度，表征了 RSIE 和 BBMV 在生理条件下的特异性 α-葡萄糖苷酶（麦芽糖酶和蔗糖酶）和 β-葡萄糖苷酶（乳糖酶）活性（U*g 蛋白?1）（表 1）。麦芽糖酶比活性在两种系统中最高，在 BBMV 中达到 905.64 U*g?1 蛋白，在 RSIE 中达到 311.55 U*g?1 蛋白。结果与

**结论**

本研究证明，用于模拟肠刷状缘阶段的酶来源关键决定了膳食（多）酚的生物可及性和水解的测定结果。商业 RSIE 促进了广泛、非特异性的水解，可能由残留的胞质和微生物酶驱动，并伴随通过非催化基质相互作用导致生物可及（多）酚的大量损失。相比之下，纯化的 BBMV 重现了选择性水解概况

**CRediT 作者贡献声明**

Pablo Gallego Lobillo：撰写 – 初稿，可视化，方法论，调查，概念化。Gianluca Picariello：方法论，调查。Gianfranco Mamone：方法论，调查。Mario M. Martinez：撰写 – 审阅与编辑，可视化，监督，方法论，资金获取，概念化。

**动物对象**

本研究按照以下动物福利和/或报告指南进行：屠宰场在适用的欧盟动物福利和食品安全法规（法规 (EC) No 1099/2009）下运营。无需伦理委员会批准。本研究不涉及使用活体动物。猪肠作为副产品从一家商业屠宰场（意大利）获得，其中动物按照标准商业

**未引用参考文献**

Gallego-Lobillo, Ferreira-Lazarte, Hernandez-Hernandez and Villamiel, 2020

**利益冲突声明**

作者声明他们没有已知的可能影响本论文报告工作的竞争经济利益或个人关系。

**致谢**

本研究由独立研究基金会丹麦的 Sapere Aude：DFF-Starting Grant (1051-00046B) 以及 BIOPOM 项目资助，该项目由 MICIU/AEI 和欧盟地平线欧洲研究与创新计划通过 FutureFoodS（食品系统可持续未来的欧洲伙伴关系）共同资助，根据拨款协议编号 101136361 共同资助。PGL 感谢 Alfonso Martin Escudero 基金会的博士后研究 Fellowship。这项工作由 Pablo Gallego Lobillo|Gianluca Picariello|Gianfranco Mamone|Mario M. Martinez