《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：A microfluidics-free hydrogel platform enables multiplex pathogen detection on food and packaging surfaces
via in situ loop-mediated isothermal amplification
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摘要食源性病原体仍是全球公共卫生的主要威胁，特别是在食品链中的传播。在本研究中，我们开发了一种无需微流控的水凝胶，用于大肠杆菌和单核细胞李斯特菌的原位环介导等温扩增（LAMP）检测，可在食品和包装材料中于20分钟内完成检测。预加载有扩增试剂（如dNTPs、引物、探针和聚合酶）
摘要
食源性病原体仍是全球公共卫生的主要威胁，特别是在食品链中的传播。在本研究中，我们开发了一种无需微流控的水凝胶，用于大肠杆菌和单核细胞李斯特菌的原位环介导等温扩增（LAMP）检测，可在食品和包装材料中于20分钟内完成检测。预加载有扩增试剂（如dNTPs、引物、探针和聚合酶）的水凝胶被用于将细菌固定在其原始位置。标记有不同荧光基团的LAMP引物被掺入扩增产物中。过量未掺入的引物通过与互补淬灭探针杂交而被淬灭。大尺寸基因组和扩增产物在水凝胶网络中的扩散受到限制，从而产生具有不同荧光颜色的扩增斑点。淬灭探针浓度分别被优化为1.28 μM和0.16 μM用于绿色和红色荧光检测系统。水凝胶中的分子扩散系数比水溶液中低77%。然后，一种深度学习驱动的解码工具被用于识别扩增斑点，识别时间小于3秒。在水果、蔬菜和包装材料上实现了不同病原体的定量检测，回收率在82.5%至117.5%之间。受限原位LAMP为食品工业中多路病原体检测提供了一个有前景的平台。
引言
尽管食品安全控制取得了进展，但与食用受病原体污染食品相关的食源性疾病暴发在全球范围内仍是一个持续的挑战（Lin等，2022；Yi、Luo、Lu、Belwal和Lin，2021）。世界卫生组织（WHO）估计，全球每年约有6亿人受到食源性疾病的影响，造成超过1000亿美元的经济损失（Wu、Fang、Zhao和Li，2023；Yang等，2022；Zhou等，2023）。即食农产品通常不经过严格的消毒或灭菌程序，从而增加了消费者接触食源性感染的风险（Yang等，2025；Zhao等，2023）。主要造成健康负担的细菌包括来自容器和农产品表面的大肠杆菌和单核细胞李斯特菌（Pekoula等，2026；Tomas Fornes、Fornes Perez、Barat Baviera、Moreno Trigos和Fuentes Lopez，2026；Yang、Falco和Nou，2026）。对病原体进行快速、准确和多重检测对于确保食品供应链和预防食源性疾病至关重要。
传统平板培养仍是食源性病原体检测的金标准，其中选择性培养基和生化试验用于初步菌株鉴定（Wu等，2023；Yang等，2021）。然而，该过程通常需要3-5天，缺乏快速、按物种区分的定量能力，增加了漏检或检测不准确的风险（Wang、Cheng、Ma、Jiang和Chen，2025）。因此，已经开发了一系列食源性病原体的快速检测策略，包括免疫层析检测、纳米酶传感器和核酸扩增技术（Chen、Liu和Lee，2022；Wang等，2023；Zhang、Belwal、Luo、Su和Lin，2021）。其中，基于核酸的检测方法将微生物鉴定从表型表征推进到分子水平，为食源性病原体提供更快速、更特异和更灵敏的检测（Song、Li和Xu，2023；Yao等，2022；Zhang等，2020）。数字核酸检测将样品分配为数千个独立的微反应，每个微反应理想情况下含有0或1个目标分子，并通过计算扩增阳性的分配区来定量目标污染（Quan等，2024；Yang等，2023；Yang等，2023；Zhao等，2024）。通过无需外部校准的精确绝对定量，可以克服早期核酸检测方法的主要局限性（Jin等，2023）。
目前，核酸扩增已逐步从热循环聚合酶链反应（PCR）转向等温形式，如环介导等温扩增（LAMP）（Kaur、Ayarnah、Duanis-Assaf、Alkan和Eltzov，2023；Malla、Shrestha和Haramoto，2024；Zhang等，2023；Zhao等，2023）。通过在恒定温度下操作，这些反应能够实现快速扩增，同时最大限度地减少热损伤和仪器需求。然而，对于固体样品（如新鲜农产品和包装材料），食源性病原体检测通常依赖于费时的样品预处理或表面涂抹（Han、Zhang、He和Jia，2021；Laborde、Martin、Swinnen和Vos，2020）。这不仅限制了现场快速检测，还无法保留目标细菌污染的空间信息（Zhang、Chen、Wang和Zhao，2024）。因此，需要避免基于涂抹的采样以实现准确的原位检测。与表面相关的病原体必须在原位进行空间限制，使靶标固定在原始位置。核酸扩增后，产生的阳性信号可以反映病原体在样品表面的空间分布。然而，现有的原位核酸检测方法通常依赖于液态试剂固定靶标，如多聚甲醛（Tao等，2023），这可能干扰靶标在样品上的原始空间分布。
生物细胞具有三维区室化的内部结构，可空间限制细胞内分子的扩散，从而支持高效的酶促反应和生理稳态（Fang等，2024）。受此特性启发，水凝胶的纳米多孔网络可能作为仿生的受限空间来限制靶标迁移（Yang等，2024；Yang等，2026）。更具体地说，水凝胶网络可以在多孔基质中空间限制核酸基因组，同时限制其自由扩散。小分子试剂可以通过三维网络扩散以支持生化反应，这通常被描述为虚拟微流控（Luo等，2026；Xu、Brito、Alm和Blainey，2016）。纳米多孔水凝胶最近已被用作单分子数字定量、扩展显微镜、核酸提取和单细胞空间组学的受限基质（Klimas等，2023；Luo等，2022；Paul等，2019；Yang等，2022；Zeng等，2023）。然而，对食品相关表面（包括水果、蔬菜和包装材料）上病原菌的直接快速原位检测仍未被探索。人工智能（AI），特别是深度学习技术，在学术和工业领域（包括食品科学与技术）变得越来越重要。人工智能与食品科学的结合使得供应链上的快速病原体监测、危害识别和食品安全风险评估成为可能（Esmaeily、Razavi和Razavi，2024；Feng等，2023；Hosny和Aerts，2019）。基于水凝胶的多路原位检测，将多色编码与人工智能辅助解码相结合，尚未有报道。
在此，我们报告了一个水凝胶限制、多色编码和AI解码的平台，用于食品相关表面上多种病原细菌的快速原位检测。水凝胶基质限制食品和包装材料表面上的细菌运动和分子扩散，而基于未掺入扩增信号报告基因（QUASR）的淬灭的多色编码实现了多重原位LAMP。AI辅助解码进一步允许对水果、蔬菜和包装材料上不同病原细菌进行快速空间定量。
章节片段
化学试剂和材料
SYBR Green I和溶菌酶购自Thermo Fisher Scientific。LAMP试剂购自New England Biolabs。4臂聚乙二醇-丙烯酸酯（4 arm-PEG-acrylate，MW 10000）和SH-PEG-SH（MW 3400）购自Laysan Bio。牛血清白蛋白（BSA）购自Takara Bio。Frame-Seal孵育腔室购自Bio-Rad。荧光探针、淬灭探针和引物由生工生物合成。引物和探针序列见表
受限原位LAMP的原理
受限原位LAMP是使用QUASR策略和水凝胶网络内的受限空间开发的（图1）。首先，预加载有扩增试剂的水凝胶被应用于食品和包装材料表面，从而将细菌固定在其原始位置。靶向各种病原体的LAMP引物被标记了不同的荧光基团。与引物序列互补的DNA探针被设计并修饰了淬灭基团。由于荧光共振能量
结论
总之，我们开发了一个无需微流控的水凝胶平台，用于食源性病原体的多重数字检测，将空间限制扩增与AI辅助荧光解码相结合。通过在一个检测过程中整合物种鉴定和定量读出，该平台为食品和包装材料表面上的病原体监测提供了一种简单且适应性强的策略。该方法可以促进现场检测，并为食源性病原体提供一个实用的工具
CRediT作者贡献声明
Yuhua Yan：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，可视化，资源，项目管理。Tao Yang：调查，概念化。Renchi Chen：方法论，调查。Jingjing Wang：撰写 – 审阅与编辑，调查。Chaofan Hu：撰写 – 审阅与编辑，验证。
未引用参考文献
Yang、Lin、Lin、Zhang和Luo，2026
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。
致谢
本研究得到了中国博士后科学基金的资助（基金号2026 M793293），以及温州市科技计划项目的资助（项目编号X2025017）。
Yuhua Yan|Tao Yang|Renchi Chen|Jingjing Wang|Chaofan Hu
Wenzhou Academy of Agricultural Science, Wenzhou 325006, Zhejiang, China
