《International Dairy Journal》：Determination of protease dynamics responsible for peptide generation in raw bovine milk
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摘要本研究使用针对类胰蛋白酶、类弹性蛋白酶、类糜蛋白酶和金属蛋白酶活性的抑制剂，调查了生鲜牛乳中蛋白酶的动力学变化。在37°C条件下孵育7天后，通过脲-PAGE、UPLC和LC-MS/MS肽组学方法评估蛋白水解情况。通过将肽段的末端与已发表的切割位点列表进行比对，将肽段归属至
摘要
本研究使用针对类胰蛋白酶、类弹性蛋白酶、类糜蛋白酶和金属蛋白酶活性的抑制剂，调查了生鲜牛乳中蛋白酶的动力学变化。在37°C条件下孵育7天后，通过脲-PAGE、UPLC和LC-MS/MS肽组学方法评估蛋白水解情况。通过将肽段的末端与已发表的切割位点列表进行比对，将肽段归属至相应的蛋白酶，并使用总强度、肽段计数和肽段中位强度评估处理效果。纤溶酶是蛋白水解的主要启动因子，尤其在β-乳球蛋白方面表现突出。金属蛋白酶似乎起到了把关者的作用，通过引入早期切割位点，增加了其他蛋白酶对酪蛋白的水解程度。类弹性蛋白酶和类糜蛋白酶可能参与了二级肽段的加工处理。不同酪蛋白中蛋白酶的贡献程度存在差异，这与协同蛋白水解网络中的底物特异性相一致。这些发现阐明了协同蛋白酶活性如何塑造乳品中的肽谱特征，并为深入理解乳品中蛋白水解的机制提供了框架。
引言
对牛乳肽组的调查研究主要集中在鉴定肽段的酪蛋白来源及其在采集自无乳房炎奶牛的生鲜乳中的潜在生物活性（Baum等，2013；Dallas等，2014；W?lk等，2020）。肽谱变化主要在亚临床乳房炎的背景下得到考察，对此广泛共识认为，感染期间肽段总丰度增加（Addis等，2020；Dalabasmaz等，2019；Guerrero等，2015）。综合现有证据来看，健康乳和乳房炎乳具有共同的肽段来源，主要为β-乳球蛋白和αs1-酪蛋白，而肽谱差异主要反映了内源性和外源性蛋白酶相对贡献的变化，而非蛋白水解靶点的改变（Dallas等，2014；Larsen等，2010；W?lk等，2020）。
在内源性蛋白酶中，即自然存在于乳中并来源于血浆、乳腺上皮细胞、乳脂球膜或体细胞等宿主来源的酶，负责肽段生成的蛋白酶包括纤溶酶、组织蛋白酶B和D以及弹性蛋白酶（Baum等，2013；Dallas等，2014）。纤溶酶被广泛认为是健康奶牛乳中的主要蛋白酶，而组织蛋白酶和弹性蛋白酶更多与体细胞计数升高的乳液相关（Wedholm等，2008）。此外，Larsen等（2010）的研究还推测乳房炎乳中存在组织蛋白酶G以及氨基肽酶和羧基肽酶活性。
在外源性蛋白酶中，即由污染微生物或乳中常驻微生物产生的微生物蛋白酶，其中研究最为广泛的是AprX——一种由嗜冷假单胞菌分泌的细胞外金属蛋白酶，该酶能耐受巴氏杀菌和超高温灭菌处理，并在乳品储存过程中促进酪蛋白分解，对乳制品质量和保质期具有重要意义（Nielsen，2002；Zhang等，2019）。
特定蛋白酶对整体蛋白水解的贡献通常根据其切割位点特异性推断（Baum等，2013；Dallas等，2014）。然而，在大多数情况下，特定蛋白酶活性与所生成肽谱之间的联系仍为相关性，尚未建立直接因果关系。此外，关于共同决定乳品蛋白水解及最终乳品肽组的蛋白酶间动态相互作用也知之甚少。现有研究通常仅提供肽谱的静态描述，并未探究导致肽段形成的逐步蛋白水解途径，包括完整蛋白的初始切割以及中间肽段进一步水解为最终产物。这一局限性在近中性pH条件（6.4-6.7）下尤为相关，该pH值对应于从健康奶牛采集的生鲜乳的生理pH值（Kandeel等，2019）。在乳品采集与后续工业加工之间发生的蛋白水解可能影响进入生产阶段的酪蛋白分解初始状态，从而影响乳制品的功能特性和最终品质（Datta & Deeth，2001；D'Incecco等，2019；Zhang等，2018）。因此，深入理解酪蛋白在此阶段的蛋白水解机制，可能为乳品行业更好地控制加工性能和产品质量提供更多机会。
基于抑制剂的实验提供了一种在系统层面考察乳品蛋白水解的方法。与选择性地开启或关闭单一蛋白酶不同，抑制剂允许对蛋白水解途径进行可控干扰，并评估蛋白酶平衡的变化如何重塑肽谱特征。在本研究中，生鲜乳在未经pH调整的情况下，与针对预期在这些条件下仍保持活性的蛋白酶类别的抑制剂一同孵育，包括类胰蛋白酶、糜蛋白酶样活性和金属蛋白酶。
重要的是，该策略并非旨在定量分析个别蛋白酶的活性，而是旨在考察对特定蛋白水解途径的扰动如何重塑乳品肽组，并揭示蛋白酶系统内的功能相互作用。通过聚焦于生鲜乳中的蛋白酶平衡、二级加工和肽段周转，本研究弥补了当前知识领域的一个关键空白，并对动态蛋白酶相互作用如何决定最终肽谱特征提供了新的见解。
章节摘要
乳样
生鲜乳样品采集自爱尔兰阿斯凯顿当地农场109头个体奶牛。相应动物元数据——包括品种、产犊日期、泌乳次数、产奶量、体细胞计数（SCC）以及蛋白和脂肪百分比——从农场管理记录中获取，以表征样本群体（表1）。乳样按等体积混合（约30 mL各），混合乳在冷藏条件下运送至科克大学实验室，
结果与讨论
本研究使用阿普替宁、弹性蛋白酶抑制剂IV、组织蛋白酶G抑制剂I和1,10-邻菲啰啉分别干扰丝氨酸、弹性蛋白酶样、糜蛋白酶样和金属蛋白酶活性，并通过LC-MS/MS肽组学评估酪蛋白衍生肽段的变化。由于抑制剂针对具有部分重叠切割特异性的蛋白酶类别，其效果被视为系统层面的扰动而非对单一酶的抑制。该
结论
这些结果支持一种模型，即生鲜乳中的蛋白水解由协同蛋白酶网络而非单一酶的线性作用所支配，最终肽组反映了肽段生成与肽段分解之间的平衡。纤溶酶型切割得到了最充分的证据支持，而AprX型切割在β-酪蛋白方面得到了证据支持。这些结论受实验设计所限：单次混合混合乳在37°C条件下孵育7天，两个重复，
CRediT作者贡献声明
Ane L. Pedersen：撰写-审阅与编辑、软件、方法学。Tiziana Racca：撰写-审阅与编辑、撰写-初稿、可视化、验证、软件、方法学、正式分析、数据管理、概念化。David A. Goulding：撰写-审阅与编辑。Michael Affolter：撰写-审阅与编辑、监督、资源、方法学。Alan L. Kelly：撰写-审阅与编辑、监督、资源、项目管理、资金获取。Jonathan O'Regan：
未引用参考文献
Larsen等，1996；Prin-Mathieu等，2002。
资金
本研究由雀巢研发中心营养部、Wyeth Nutritionals Ireland、Askeaton, Co. Limerick, 爱尔兰资助。
利益冲突声明
? 作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢：
作者衷心感谢Conor O'Brien在本研究中对乳样协调与收集以及农场遗传数据提供所作出的重要贡献。
Tiziana Racca|Ane L. Pedersen|Michael Affolter|David A. Goulding|Jonathan O'Regan|Alan L. Kelly
