柑橘黄酮橙皮素与柚皮素重塑儿童龋病相关口腔微生物组：一项探索性宏基因组研究

《Journal of Agriculture and Food Research》：Citrus Flavonoids Hesperetin and Naringenin Remodel the Caries-Associated Oral Microbiome: An Exploratory Metagenomic Study

　　

柑橘黄酮橙皮素与柚皮素重塑龋病相关口腔微生物组：一项探索性宏基因组研究
柑橘源橙皮素（hesperetin）与柚皮素（naringenin）重塑儿童龋病相关口腔微生物组。
黄酮处理改变与生物膜形成相关的碳水化合物活性酶（CAZyme）谱。
橙皮素与柚皮素驱动口腔微生物群向不同的生态轨迹演变。
这些发现支持将富含黄酮的功能性食品用于儿童龋病预防。

龋病是儿童最常见的慢性疾病之一，口腔微生物群在其发生发展中起关键作用。早期研究聚焦于变形链球菌等特定病原体，但宏基因组测序已证实龋病本质上是口腔微生物群落失调的结果。黄酮类化合物广泛分布于植物中，具有抗氧化、抗菌、抑制酶活性等生物活性。然而，特定黄酮对复杂口腔微生物群落的影响，尤其是对儿童龋病相关微生物组的作用，尚未见报道。现有研究主要停留在健康和龋病状态的静态比较，缺乏主动调节菌群失调的干预研究；儿童口腔微生物组是可塑性较强的发育期生态系统，是龋病预防的关键窗口，但靶向干预研究极少。因此，研究人员开展此探索性研究，利用宏基因组测序表征橙皮素（Hesp）和柚皮素（Nar）对龋病儿童口腔微生物组群落结构和功能谱的体外调节作用。

研究人员从深圳市福田区妇幼保健院招募11名龋病患儿，收集唾液样本，分别与Hesp和Nar共孵育24小时，进行宏基因组测序及多数据库功能注释。结果显示，两种黄酮均可引起大规模基因丰度重塑，平均39%的注释基因丰度变化超过70%；处理与碳水化合物活性酶（CAZyme）谱改变相关，尤其是糖基转移酶和糖苷水解酶类；β多样性分析显示Hesp和Nar处理组与对照组在分类和功能水平均呈现分离，且两种黄酮各自占据不同的生态位。这些发现为开发富含黄酮的功能性食品以预防儿童龋病提供了初步的宏基因组学证据。

主要技术方法：研究样本来自深圳市福田区妇幼保健院11名龋病患儿。采用DNBSEQ-T7平台进行宏基因组测序；原始数据经Trimmomatic质控、KneadData（v0.10.0）去宿主序列；MEGAHIT（v1.2.9）从头组装；Prodigal（v2.6.3）基因预测；CD-HIT（v4.8.1）构建非冗余基因集（覆盖度>90%，一致性>95%）；DIAMOND比对nr亚数据库并进行MEGAN的LCA分类；功能注释使用Micro NR、EggNOG、GO、KEGG、CAZy、CARD和VFDB数据库；α/β多样性分析使用QIIME2和R软件包。测序数据已提交至NCBI SRA（BioProject PRJNA1379526）。

研究结果部分：

3.1 Sequencing Data Quality and Assembly
所有样本Q20>98%，Q30>94%，符合宏基因组分析要求。成功构建非冗余基因集，G1-G5样本包含853,245条序列，G6-G11样本包含626,529条序列，多数基因序列长度<1000 bp。

3.2 Sequencing Depth and Assembly Quality Assessment
Nonpareil覆盖度分析显示，在95%覆盖度阈值下，Hesp和Nar处理组的估计测序量（LRstar）高于对照组，提示处理组群落可能更复杂或未被完全捕获。N50值在样本间呈不一致趋势，reads比对率>90%，表明组装结果可靠。

3.3 Hesp and Nar Modulate Non-Redundant Gene Abundance
在所有11个样本组中，平均39%的注释基因相对丰度变化超过70%。多数样本组中Hesp处理组受影响基因比例高于Nar处理组（如G5为43% vs. 39%），提示Hesp可能具有更强的全局基因丰度调节作用。

3.4 Functional Annotation Reveals Treatment-Associated Shifts in Metabolic Potential
GO注释显示处理组与对照组在“细胞过程”“代谢过程”“催化活性”“结合”等功能类别上存在分布差异。KEGG通路水平差异幅度较小，但Hesp处理组KO条目数通常高于Nar组。EggNOG中“功能未知”类别相对丰度最高，反映参考数据库的局限性。CAZy注释显示糖基转移酶和糖苷水解酶类在多个Hesp处理样本中相对丰度增加，与黄酮调节碳水化合物代谢和生物膜基质合成的已知作用一致。CARD注释显示糖肽类耐药基因相对丰度较高，苯丙醇类耐药基因较低。VFDB注释中毒力因子类别数恒定为14，但具体毒力因子数目随样本变化，呈双向模式。

3.5 Taxonomic Composition Analysis
3.5.1 Species Distribution and Taxonomic Groups
细菌在所有样本中占主导地位。在物种水平，不同处理组的注释物种数存在样本依赖差异（如G4_Hesp为1,855种，G4_NC为1,782种），反映口腔微生物组的个体化特征。
3.5.2 Alpha Diversity
Shannon指数变化因个体而异：G1组黄酮处理后降低（NC 2.73，Hesp 2.56，Nar 2.66），而G8组则升高。所有样本goods_coverage指数>0.9997，表明测序深度充分。
3.5.3 Beta Diversity Based on Species Abundance
基于clr变换的PCA、Bray-Curtis和Binary-Jaccard距离的PCoA以及NMDS（stress<0.2）均显示Hesp和Nar样本与对照组趋向分离，且两种黄酮在排序空间中占据不同区域。由于样本量小，未进行正式统计检验，仅作描述性展示。

3.6 Functional Composition Analysis
基于功能注释数据的PCA显示处理组与对照组沿PC1轴明显分离（PC1解释50.74%-61.11%方差），PCoA和NMDS（stress分别为0.1159和0.0653）进一步支持该模式。Hesp和Nar样本彼此也呈现不同聚类，提示两者可能通过部分不同的机制影响口腔宏基因组。

讨论部分指出，该研究是首批对黄酮调节龋病儿童口腔微生物组进行宏基因组表征的探索性工作。两种黄酮均能引起系统性基因重组，影响超过三分之一的基因池，且Hesp影响比例略高。CAZy家族差异提示其对胞外多糖合成和膳食糖代谢的潜在影响，但宏基因组测序仅反映基因丰度而非转录活性，需宏转录组或代谢组验证。β多样性分析中两种黄酮的分离提示其结构差异（仅差一个羟基）可能转化为不同的生态效应。儿童口腔微生物组的可塑性使膳食黄酮成为早期龋病干预的候选策略。局限性包括：样本量小（n=11）、体外批次培养无法模拟体内复杂环境、单浓度单时间点设计、缺乏菌株水平分辨率。所有结果均为假设生成性质，需在独立队列和体内模型验证。

结论部分可翻译为：这项探索性宏基因组研究初步描述了Hesp和Nar对龋病儿童口腔微生物组的体外调节作用。所有发现均为假设生成性质，需在独立队列和体内模型中验证。在此前提下，主要初步观察包括：（i）两种黄酮均与该初步队列中广泛的基因丰度重塑相关，平均39%的注释基因丰度变化超过70%；（ii）功能注释揭示了处理相关的碳水化合物活性酶谱和代谢通路表征变化；（iii）β多样性排序描述性提示两种黄酮在组成空间中占据不同区域，尽管这些视觉模式未经统计检验。综上所述，这些假设生成性发现提示饮食黄酮可能具备通过生态学机制在体外重塑龋病相关口腔宏基因组的能力，并为未来研究提供了基础基因组资源。