打破物理与免疫屏障：中性粒细胞仿生纳米药物增强胰腺导管腺癌（PDAC）免疫治疗

《Journal of the National Cancer Center》：Breaking physical and immunological barriers: a neutrophil-mimicking nanotherapeutics for enhanced pancreatic cancer immunotherapy

　　

背景：免疫治疗在胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）中的疗效受到高度免疫抑制性和纤维化肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的严重限制。异常排列的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）形成了强大的物理屏障，阻碍细胞毒性T细胞浸润，同时促进免疫抑制。开发能够有效重塑这种病理性基质结构以增强免疫排斥反应并缓解免疫抑制性TME，从而提高免疫治疗疗效的策略仍然至关重要。

方法：研究人员通过将DDR1和LOXL2抑制剂包封于两亲性肽胶束中，并包被中性粒细胞膜，开发了一种仿生纳米药物（NM-PL@DDR1）。研究人员在体外表征了纳米颗粒的理化特性和免疫调节功能。利用原位PDAC小鼠模型，研究人员研究了其体内靶向能力、ECM重塑功效和抗肿瘤免疫。该研究进一步评估了NM-PL@DDR1与PD-1阻断联合治疗的潜力。

结果：成功构建的NM-PL@DDR1具有良好的理化特性、优异的稳定性和pH响应性药物释放特征。中性粒细胞膜包被赋予了其优越的肿瘤靶向能力和炎症趋向性，促进了肿瘤部位的高蓄积。在体内，NM-PL@DDR1有效地将线性化胶原结构重塑为无序状态，且不减少胶原含量，从而打破物理屏障。这种重塑伴随T细胞和M1巨噬细胞浸润的显著增加。因此，与抗PD-1单药治疗相比，NM-PL@DDR1与抗PD-1抗体联合显示出优越的抗肿瘤疗效，肿瘤重量降低52%，这与CD8⁺ T细胞细胞毒性功能的增强相关。

结论：该研究证明NM-PL@DDR1是一种创新的仿生纳米平台，可以同时使异常的基质结构排列正常化并重编程免疫抑制性TME。研究结果提供证据表明，重塑基质结构是增强PDAC患者检查点阻断免疫治疗疗效的一种有前景的策略。这项临床前研究提供了一种有前景的联合策略，值得进一步评估以克服这种高度致命恶性肿瘤的免疫治疗耐药特征。

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是一种高度致命的恶性肿瘤，5年生存率不足10%。免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）在多种实体瘤中取得了成功，但在PDAC中疗效甚微，单用或联合化疗均未给患者带来显著生存获益。这种治疗抵抗主要源于PDAC独特的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）：致密的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积、细胞毒性T细胞浸润稀少、免疫抑制性髓系细胞和癌症相关成纤维细胞富集。既往研究证实，PDAC的ECM呈线性排列结构，这种异常排列的胶原纤维不仅构成物理屏障，阻碍药物渗透和免疫细胞进入肿瘤核心，还与患者不良预后相关。针对基质成分的治疗策略虽然已有探索，但结果大多不理想，甚至可能加速肿瘤进展。因此，迫切需要开发能够重塑病理性ECM结构并逆转免疫抑制TME的新策略。该研究在此基础上，设计了一种中性粒细胞膜仿生纳米药物NM-PL@DDR1，用于同时调控基质结构和免疫微环境，增强免疫治疗疗效。论文发表在《Journal of the National Cancer Center》。

研究人员首先通过固相肽合成和酰胺缩合反应制备了两亲性肽段APB-L（VVVVVVKKGRGDSGFLG-LOXL2抑制剂偶联物），利用肽自组装技术包载脂溶性DDR1抑制剂形成纳米胶束核心PL@DDR1；随后提取并激活小鼠骨髓中性粒细胞，经超声破碎和密度梯度离心获得中性粒细胞膜（neutrophil membrane，NM），通过挤出法将NM包被在PL@DDR1表面，制得NM-PL@DDR1。体外采用动态光散射、透射电镜、Western blot、TMT蛋白质组学等对纳米粒的理化性质、稳定性和膜蛋白组成进行表征。体内使用KPC细胞（源自LSL-Kras^G12D;LSL-Trp53^R172H;Pdx1-Cre小鼠）与小鼠胰腺星状细胞（M-PSCs）共接种于C57BL/6小鼠胰腺尾部构建原位PDAC模型，通过二次谐波成像（SHG）、CT-FIRE分析胶原排列，原子力显微镜（AFM）检测组织硬度，胶原交联ELISA、流式细胞术、单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）等评估ECM重塑和免疫微环境变化，并开展联合PD-1抗体治疗及免疫细胞耗竭实验。

### 3.1 NM-PL@DDR1的制备与表征

成功构建的NM-PL@DDR1呈球形核壳结构，水合粒径约145 nm，zeta电位约?34.4 mV，在4 ℃ PBS中7天内保持稳定。该纳米粒具有pH响应性药物释放行为，在pH 6.4条件下DDR1抑制剂持续释放，而pH 7.4条件下释放极少。Western blot和TMT蛋白质组学分析显示，NM-PL@DDR1保留了中性粒细胞膜上的关键功能蛋白，包括黏附分子LFA-1（ITGAL）、ITGAM以及炎症相关受体TNFR2、IL-1R1等，为肿瘤归巢和免疫调节奠定了基础。

### 3.2 NM-PL@DDR1的肿瘤靶向能力与炎症趋向性

体外细胞摄取实验显示，NM-PL@DDR1在KPC细胞中的荧光摄取量显著高于PL@DDR1和NM组。原位PDAC模型中，NM-PL@DDR1在肿瘤部位的蓄积量最高，血液循环时间延长。利用血管内皮-ECM Transwell模型证明，NM-PL@DDR1穿越血管内皮的能力最强，且肿瘤条件培养基可进一步增强其跨内皮迁移。微尺度热泳（MST）实验测得NM-PL@DDR1与ICAM-1的结合亲和力K_D为290 nM，证实了LFA-1/ICAM-1介导的炎症趋向性。此外，NM-PL@DDR1能有效抑制LOXL2酶活性，并通过中性粒细胞膜“细胞因子海绵”作用浓度依赖性地吸附TNF-α、CXCL2和GM-CSF等免疫抑制性细胞因子。

### 3.3 NM-PL@DDR1驱动肿瘤基质和免疫微环境重塑

在原位PDAC模型中，SHG成像和CT-FIRE纤维分析显示，NM-PL@DDR1治疗可将高度取向的线性胶原纤维转变为松散无序的排列，胶原排列系数（CV值）较对照组提高约2倍，且不减少总胶原含量。AFM测量显示肿瘤组织硬度从对照组的5.04 kPa降至2.33 kPa，成熟的胶原交联产物吡啶啉（PYD）和脱氧吡啶啉（DPD）水平也显著降低。流式细胞术和免疫组化结果显示，NM-PL@DDR1显著增加CD45⁺免疫细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和M1型巨噬细胞浸润，同时减少M2型巨噬细胞，并上调肿瘤组织PD-1表达。scRNA-seq进一步揭示，NM-PL@DDR1处理增加了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和Th1细胞亚群比例，提高M1/M2比值，并增强肿瘤细胞与CTL、M1巨噬细胞之间的配体-受体相互作用，上调抗原处理和提呈、MAPK信号等通路。安全性评估显示该纳米药物对主要器官无明显毒性，不引起明显炎症反应。

### 3.4 NM-PL@DDR1与抗PD-1抗体的联合治疗疗效

在KPC-luci/M-PSC原位模型中，尽管单独使用NM-PL@DDR1或PD-1抗体对肿瘤生长抑制作用有限，但两者联合治疗显著抑制肿瘤进展：终点肿瘤生物发光信号较PD-1单药组降低74%，肿瘤重量较抗PD-1单药降低52%，小鼠中位生存期从PD-1单药组的26.5天延长至33天。免疫组化显示联合组增殖标志物Ki67显著降低、凋亡标志物cleaved caspase-3显著升高。流式分析表明，联合治疗使肿瘤内CD8⁺ T细胞和M1巨噬细胞分别增加3.6倍和2.1倍，M2巨噬细胞减少58.4%，同时CD8⁺TNF-α⁺和CD8⁺IFN-γ⁺ T细胞比例显著上升。CD8⁺ T细胞耗竭后联合治疗抗肿瘤效果基本消失，而巨噬细胞耗竭仅部分削弱疗效，表明CD8⁺ T细胞是主要效应细胞，巨噬细胞发挥辅助作用。

讨论部分指出，该策略的有效性依赖于ECM结构重塑与中性粒细胞膜免疫调节的协同作用。与既往基质消融策略不同，NM-PL@DDR1在不消耗胶原的情况下改变纤维排列，避免了去基质化可能带来的侵袭表型风险。scRNA-seq为NM-PL@DDR1调节不同免疫细胞亚群提供了机制学证据。研究也存在局限性：中性粒细胞初始纯度约为73%，但蛋白质组学证实最终纳米平台富集了中性粒细胞关键功能蛋白并排除了主要污染细胞标志物；单细胞层面的机制探索仍属初步分析；该策略还需在自发性PDAC模型及其他纤维化免疫抑制肿瘤中进一步验证。总之，研究人员构建了中性粒细胞膜仿生纳米药物NM-PL@DDR1，通过重塑ECM结构和破坏免疫屏障显著增强了PDAC的抗肿瘤免疫，为免疫检查点阻断治疗创造了有利的微环境。该研究不仅为PDAC提供了一种有前景的联合治疗策略，也为其他免疫抑制性肿瘤的治疗策略开发提供了新思路。