《Food Science & Nutrition》：Developing an Analytical Framework for the Molecular Weight Analysis of Fish-Derived Collagen Peptides in Beverages: A Multi-Method Comparative Study
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准确测定胶原蛋白肽的分子量对于功能性饮料的质量控制至关重要。当前针对肽粉的国家标准和行业标准方法在应用于复杂饮料体系时，面临基质干扰和可比性不足的挑战。本研究系统评估了三种主流色谱方法在测定饮料中鱼源胶原蛋白肽分子量（MW）方面的适用性、重现性和一致性。通过识
准确测定胶原蛋白肽的分子量对于功能性饮料的质量控制至关重要。当前针对肽粉的国家标准和行业标准方法在应用于复杂饮料体系时，面临基质干扰和可比性不足的挑战。本研究系统评估了三种主流色谱方法在测定饮料中鱼源胶原蛋白肽分子量（MW）方面的适用性、重现性和一致性。通过识别并去除来自非肽辅料的干扰峰，随后对线性和三次拟合模型进行系统比较，建立了一套分析框架。三种方法均表现出良好的重现性。去除干扰峰后，饮料的肽谱与纯肽粉高度一致。三次拟合降低了方法间差异，在具有生物活性的<1 kDa范围内，相对标准偏差（RSD）值低于5%。该框架通过饮料配方优化得到进一步验证，证明了功能性成分质量控制与感官风味可调性之间的兼容性。所提出的方法为胶原蛋白肽饮料的工业质量控制和跨实验室数据可比性提供了实用解决方案。
**基于多方法比较的鱼源胶原蛋白肽饮料分子量分析框架构建：研究解读**
**一、研究背景与问题提出**
随着生活水平提高和人口老龄化加剧，对抗皮肤衰老已成为广泛关注的健康议题。皮肤衰老的主要表现包括由胶原蛋白和弹性纤维流失引起的干燥、松弛、色素沉着、毛细血管扩张及皱纹等，其机制涉及自由基与氧化应激、炎症反应及非酶糖基化。在美容健康领域，抗衰老产品市场需求持续增长，口服或外用补充胶原蛋白及其相关活性成分已成为重要途径。鱼源小分子肽主要通过鱼皮、鱼鳞、鱼骨等副产物的酶解制备，因其低致敏性、高生物利用度以及抗氧化、抗炎、抗衰老和组织修复等多种生物活性，被广泛应用于功能性食品、保健品和化妆品中。
胶原蛋白和弹性蛋白是维持皮肤完整性和功能性的核心结构蛋白，二者共同构成细胞外基质网络，提供机械强度和弹性回缩力。外源性胶原蛋白肽可通过促进成纤维细胞活性和增加透明质酸合成来改善皮肤状况、延缓光老化；同时，通过抑制基质金属蛋白酶MMP-1和MMP-3的释放来保护细胞外基质免于降解。弹性蛋白及其衍生肽可刺激I型前胶原蛋白合成、增强皮肤弹性，并通过调节弹性蛋白酶活性发挥光保护作用。抗衰老领域的营养补充剂常将胶原蛋白肽与维生素和抗氧化剂联用以实现协同效应，胶原蛋白与弹性蛋白肽的联合使用因其在增强结构完整性和抑制基质降解方面的互补作用而受到特别关注。
尽管胶原蛋白和弹性蛋白肽在抗衰老应用中显示出明确潜力，但其生物活性和产品质量高度依赖于肽的分子量分布、组成和结构。研究人员前期对胶原蛋白肽饮料的研究证实，在3个月加速储存期间分子量分布保持稳定，<1 kDa组分占比超过65%，ABTS自由基清除活性维持在80%–90%。目前，针对鱼源胶原蛋白肽的分子量测定已建立了多项国家标准和行业方法，但这些方法主要针对单一成分的肽粉原料。在实际应用中，肽类成分往往以饮料等复杂形式消费，其中添加的维生素、有机酸、香精及其他辅料可能在分析过程中引起基质干扰。更为关键的是，不同检测方法在色谱条件和数据处理模型上的差异尚未经过系统评估以确认其结果的一致性和可比性，这对行业质量控制和标准化构成了挑战。
因此，本研究聚焦于胶原蛋白与弹性蛋白肽的复合体系，评估三种主流凝胶渗透色谱（GPC）方法在饮料基质中的适用性、重现性和结果一致性。通过比较不同色谱条件和数据处理模型（线性和三次拟合）对分子量分布及关键参数的影响，评估基质抗干扰能力、数据可比性和实际可行性，旨在建立适用于复杂饮料体系的检测与评价程序，支持跨平台数据比较，为胶原蛋白肽功能性饮料的质量控制、标准化和产品创新提供方法论基础。
**二、研究设计与关键技术方法**
研究采用了三种分别对应不同中国标准的方法：方法A（企业标准Q/HNHY 002-2021）、方法B（国家标准GB 31645-2018）和方法C（推荐性国家标准GB/T 22729-2008），三种方法的主要差异在于流动相组成。所有色谱分析均使用配备二极管阵列检测器的HPLC系统（LC-20AT，岛津）和TSK-GEL G2000 SWXL色谱柱（300×7.8 mm，5 μm；TOSOH），流速0.5 mL/min，柱温30°C，紫外检测波长220 nm。测试样品包括两种市售饮料（北京清研博实健康管理有限公司产品，品牌"五大夫"），分别命名为胶原蛋白-VC饮料和胶原蛋白-EGCG饮料，以及由海南华研胶原科技有限公司提供的与市售饮料同批次的胶原蛋白肽（CP）和弹性蛋白肽（EP）原料配制的空白对照样品。样品以相应流动相稀释至肽浓度为5 mg/mL，超声处理10 min，经0.22 μm滤膜过滤后进样，进样量10 μL。采用LabSolutions软件（Version 5.124）依据标准品校准曲线计算分子量分布及数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）和粘均分子量（Mv）等参数。色谱指纹相似度评价采用中国药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（Version 2012.130723），以胶原蛋白肽粉色谱图为参照指纹。风味分析采用电子鼻（PEN3，AIRSENSE，德国）和电子舌（INSENT，SA402B，日本）对样品进行客观感官评价。统计分析使用GraphPad Prism 8，方法间比较以相对偏差百分比（RD，%）判断显著性，参照国家标准中重复性条件下两次独立测定结果绝对差不超过算术平均值10%的通用要求。
**三、主要研究结果**
**3.1 分析方法比较**
在校准曲线拟合效果比较中，三种方法的线性拟合R2范围为0.9925至0.9978；采用三次多项式重新拟合后，三种方法校准模型的R2提高至0.9970至0.9999，RMSE从0.0579–0.0970降至0.0023–0.0367，拟合精度显著提升。其中方法B表现最佳，R2达0.9999，RMSE仅0.0023。残差分析显示，线性拟合的残差均呈现明显的U形或倒U形趋势，表明线性模型存在系统性偏差；三次拟合的残差基本随机分布在零线附近，多数残差值在±0.05以内，模型相对合理且可接受。在重复性和精密度验证中，三种方法标准品保留时间的RSD均低于0.1%，理论塔板数（N）分别为11436、5924和2764，均高于系统适用性要求的N>2000。对肽粉及两种饮料样品在五种分子量范围（>3 kDa、2–3 kDa、1–2 kDa、0.5–1 kDa、<0.5 kDa）和三个关键分子量参数（Mn、Mw、Mz）的RSD计算结果显示，所有样品的RSD均低于3%，确认三种方法均具有良好的重复性和精密度。
**3.2 饮料基质干扰的识别与排除及肽谱一致性验证**
为识别和排除饮料基质干扰，研究人员比较了肽标准品和代表性饮料辅料在三种流动相条件下的保留时间。最小肽标准品GGG（189 Da）在三种方法中约在19.5 min出峰，峰尾延伸至20.0 min。三种检测方法下，纯肽粉和两种饮料在20.5 min前的分子量分布谱图高度一致，表明肽组分主要在此区域洗脱。维生素C（VC）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）均在20.5 min后洗脱，证实饮料基质中常见的功能性添加剂出现在晚洗脱区域。累积分子量分布分析显示，两种饮料中<189 Da组分的表观比例显著偏高，最高达总分布的20%，确认这些信号主要来源于非肽类物质。因此，后续分析中排除了20.5 min后洗脱的峰。排除干扰峰后，三种样品的色谱图高度重叠，各分子量范围的相对偏差均低于10%，表明结果准确反映了饮料基质中胶原蛋白肽的真实分子量分布，与纯肽粉一致。这归因于部分辅料（如多糖）因缺乏共轭发色团在220 nm处紫外吸收较弱，其贡献可忽略不计。色谱指纹相似度分析进一步验证，以纯肽粉指纹为参照，两种饮料指纹与参照的相似度相关系数均超过0.99。
**3.3 不同方法间分子量分布的一致性**
排除基质干扰后，对三种检测方法获得的肽粉和饮料样品分子量分布结果进行系统评估。在线性拟合下，三种方法在>3 kDa范围内存在显著差异；在0.5–1 kDa范围内，方法A和方法B无显著差异，但均与方法C差异显著。在三次拟合下，方法间差异显著减小，仅在0.5–1 kDa和<0.5 kDa范围内方法C与方法A/B之间仍存在显著差异。鉴于生物活性小分子肽主要集中在<1 kDa范围，对该区间内子范围数据进行了合并分析。在线性拟合下，方法A和方法B无显著差异，但均与方法C差异显著；在三次拟合下，三种方法之间均无显著差异（RD <10%）。更重要的是，三次拟合下方法间的RSD值均低于5%，表明三次拟合能有效降低方法间的系统偏差，提高这一关键分子量范围的一致性。
**3.4 不同方法间分子量参数的一致性**
分子量参数分析显示，在线性拟合下，方法C与方法A/B在Mn、Mw和Mz上存在显著差异，而ρ（Mn/Mw）和d（Mz/Mw）无显著差异。在三次拟合下，五种参数（Mn、Mw、Mz、ρ、d）在三种方法间均无显著差异。关键参数Mw在不同拟合方式下呈现规律性变化趋势（线性：C>A>B；三次：A>B>C），这一转变清晰表明三次拟合能有效消除大多数参数在方法间的统计学差异，显著提高结果一致性。
**3.5 拟合方法对测量结果的影响**
为直观比较不同拟合方式对分子量分布和参数计算的影响，对三种方法在线性和三次拟合间的结果差异进行了雷达图分析。以RD 10%为显著性判据，除个别参数存在极端偏差外，总体偏差幅度顺序为：方法A（0%–15%）<方法B（5%–20%）<方法C（20%–35%），表明方法A受拟合方式影响最小、结果一致性最佳，方法C受影响最为显著。
**四、讨论总结与结论**
在讨论部分，研究人员从四个方面进行了深入阐释。第一，建立并验证了抗基质干扰的分析策略。核心创新包括两步：首先通过色谱识别并系统排除归属于非肽类紫外吸收辅料的晚洗脱峰（>20.5 min）；其次在GPC数据处理中应用三次拟合。三种色谱方法对纯肽粉和饮料基质均获得高度一致的结果（RSD<3%），干扰峰排除后纯肽粉与饮料的分子量分布谱图和关键参数对齐，经验证策略有效。所选色谱条件结合采集后数据处理能有效"过滤"常见饮料添加剂引入的光谱和流体动力学噪声，分离出胶原蛋白和弹性蛋白肽群的特异性信号。第二，阐明数据拟合对方法间可比性的关键作用。所有三种方法均表现出良好的重现性（RSD<10%），为横向比较提供了可靠基础。线性拟合下方法间在关键分子量范围和关键参数上存在显著差异，主要原因是酶解产物具有跨越多个数量级的宽多分散性，使保留时间与lg(MW)之间呈现明显非线性关系，三次多项式比线性回归能更有效捕获这一关系。三次拟合展现出卓越的协调能力，通过更灵活地贴合凝胶色谱的分子筛特征，有效消除了流动相差异引入的系统偏差，使三种方法结果高度一致。基于此，研究提出实用分析框架：若行业采用三次拟合作为参考数据处理方式，不同检测方法的结果将可直接比较；若短期内拟合条件无法统一，方法A因其在不同拟合模式下具有更好的稳健性，可作为现阶段的首选参考方法。第三，验证了配方优化与核心成分分析之间的兼容性。物理化学分析显示，与纯肽粉相比，两种饮料中VC、浓缩果汁、壳寡糖和果胶等辅料的加入导致pH降低和粘度增加，有助于改善物理稳定性和延长货架期。电子鼻和电子舌的客观风味分析显示，饮料与肽粉之间存在显著差异，饮料在多个传感器上显示出更强的响应信号，风味成分更复杂；滋味分析表明饮料的鲜味、咸味、甜味和酸味分布较肽粉更加平衡协调。关键的是，GPC结果证实这些水溶性辅料的引入及由此产生的理化性质变化和风味体系塑造，并未干扰胶原蛋白肽分子量及其分布的准确测定，表明功能成分的稳定性与产品感官风味的可调性在配方体系中兼容。企业可在确保核心肽质量一致的前提下自由优化风味和调整物理稳定性。第四，指出研究局限性和未来方向。实验仅在单一HPLC系统上完成，仅验证了仪器精密度，未进行跨平台验证，未来应在至少两个不同仪器平台上开展研究以确认普适性。干扰排除策略尚未在其他饮料基质中测试，原因是难以获得与商业化产品同批次的肽粉原料进行准确验证，但大多数常见饮料组分因缺乏共轭发色团或肽键在220 nm处紫外吸收弱或可忽略，该排除规则在其他基质中的适用性需逐案验证，对于未知基质的常规应用，建议采用加标回收实验或空白基质运行以确认无干扰。TSK-GEL G2000 SWXL色谱柱在<500 Da低分子量范围内分辨率和准确性存在一定局限，该范围内肽分子量差异仅相当于1–2个氨基酸残基，流体动力学体积差异极小，导致色谱峰平滑；已有研究表明Superdex系列色谱柱对小分子肽的分离分辨率优于TSK-GEL G2000 SWXL，但其单次分析时间长达1.5 h且柱平衡时间长，难以满足高通量日常质控需求；因此对<500 Da区间的精细表征，建议结合LC-MS/MS或专用小分子SEC色谱柱进行交叉验证。此外，GPC校准曲线的非线性是尺寸排阻色谱中的普遍现象，虽然三次拟合表现出良好的协调能力，但探索其他先进数据处理方法有望进一步优化精度和扩展适用性。未来研究可进一步探索该方法获得的精确肽谱与体外生物活性（如抗氧化能力、胶原合成效应）或临床疗效终点之间的直接相关性，实现分析一致性与功能可预测性的有效连接。
在结论部分，研究人员将研究结论翻译并总结为：本研究建立了适用于复杂饮料基质中鱼源胶原蛋白肽分子量分析的实用分析框架，做出三项关键贡献。第一，验证了20.5 min色谱截断值可用于排除饮料辅料产生的非肽干扰，确保所测谱图准确反映真实肽分布。第二，确定三次拟合在降低方法间变异性方面优于线性拟合，在<1 kDa范围内实现了低于5%的RSD。第三，证明该框架与配方优化兼容，可同时控制肽质量和感官属性。本研究为弥补现有标准在数据处理方面的细节缺失提供了初步指导，并为验证数据准确性的分析数据交叉比较提供了实用策略。然而，仍需要进一步验证，未来工作应将此方法扩展到更多仪器平台、不同色谱柱批次和更广泛的肽基饮料基质，以验证其适用性和稳健性，从而为行业提供更全面的质量控制工具。
