《Communications Biology》：Spatial proteomics identifies FXYD6 as a dual-site protein of neuromuscular junction in the diaphragm
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研究人员利用空间蛋白质组学（spatial proteomics）技术对小鼠膈肌（diaphragm）进行了系统分析，共鉴定出115种在神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）区域富集的蛋白质。通过比较NMJ与肌腱连接（myote
研究人员利用空间蛋白质组学（spatial proteomics）技术对小鼠膈肌（diaphragm）进行了系统分析，共鉴定出115种在神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）区域富集的蛋白质。通过比较NMJ与肌腱连接（myotendinous junction, MTJ）的蛋白质特征，研究人员发现了31种在这两种结构中共同表达的蛋白质，提示这些连接结构之间部分保守的分子组成。在NMJ富集组分中观察到了突触传递和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组织的关键介导因子，揭示了NMJ的分子复杂性和调控潜力。针对尚未表征的NMJ蛋白FXYD6的深入研究显示，FXYD6在膈肌IIa型肌纤维中表达增强，此类肌纤维具有氧化和糖酵解能力的独特平衡。FXYD6与膈肌中的Na?/K?-ATPase亚基相互作用，支持FXYD6在维持离子稳态（ionic homeostasis）中发挥作用，这种稳态是持续、抗疲劳收缩所必需的。总体而言，该数据集提供了膈肌NMJ的全面分子图谱，为解析呼吸功能和神经肌肉疾病相关突触机制开辟了新的研究途径。
**一、研究背景与科学问题**
膈肌是机体持续收缩的骨骼肌，受双侧膈神经支配。神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）作为运动神经末梢与肌纤维之间的特化突触结构，将运动神经元动作电位转化为化学信号，触发突触后膜去极化和肌肉收缩。此外，运动神经元还指导突触处肌核表达特定基因，局部调控的蛋白质合成可能协调肌内功能区的组装。然而，目前对NMJ结构的全面蛋白质组学分析仍然缺乏，这限制了对突触前、突触后组分及邻近细胞和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）蛋白质精确分子组成的认识。传统形态学研究虽提供了膈肌结构细节，但无法全面揭示分子网络。现代质谱仪灵敏度显著提升，可分析亚纳克级蛋白质样品，但对NMJ结构进行无偏液相色谱-串联质谱（LC-MS）分析此前尚未开展。因此，绘制膈肌纵向空间蛋白质图谱并精确解析NMJ分子组成，对理解NMJ调控突触活性、维持结构完整性和控制骨骼肌收缩具有重要意义。
**二、研究内容与主要结论**
为绘制膈肌空间蛋白质图谱，研究人员从小鼠分离膈肌，包埋内侧膈肌条带，制备薄冷冻切片（20 μm），采用短LC-MS梯度（11 min或21 min）进行分析，单切片平均鉴定约2500种蛋白质。通过神经丝蛋白、胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase, ChAT）和多种NMJ特异性蛋白标志物识别，精确定位NMJ和MTJ区域。数据分析显示，115种蛋白质在NMJ呈现峰强度最大值，92种在MTJ呈现最大值，31种在NMJ和MTJ均呈现双峰，其中包括ECM组织和神经支配相关蛋白，提示两者共享部分结构特征。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示NMJ富集蛋白涉及神经丝束组装、胶质细胞分化和基底膜转运机制等生物学过程。
研究人员进一步聚焦未表征NMJ蛋白FXYD6（离子转运调节因子6，又称phosphohippolin）。免疫印迹分析显示FXYD6在脑组织中表达最高，膈肌与比目鱼肌表达水平相近，趾长伸肌表达较低。原代成肌细胞分化体系证实FXYD6在肌生成过程中表达逐渐增加。免疫共染色结果显示FXYD6主要表达于MYH2阳性（IIa型）肌纤维，较少表达于MYH7阳性（I型）肌纤维。与α-银环蛇毒素（bungarotoxin, BTX）共染色证实FXYD6定位于NMJ区域质膜。AChR聚集实验显示，agrin刺激后FXYD6与乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor, AChR）簇共定位且染色强度增加。通过免疫沉淀结合质谱分析，研究人员鉴定出FXYD6与多种Na?/K?-ATPase亚基（包括ATP1A1、ATP1A3、ATP1B3等）在C2C12成肌细胞、SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞以及膈肌和脑组织中相互作用。基于上述发现，研究人员提出FXYD6在膈肌IIa型和IIx型肌纤维中通过调节Na?/K?-ATPase活性，维持离子稳态以支持持续节律性收缩功能的假说。
**三、主要技术方法**
研究人员从成年（约3月龄）野生型C57BL/6小鼠（饲养于德国北莱茵-威斯特法伦州，实验经当地政府机构LANUV批准）分离膈肌、比目鱼肌等组织。核心技术方法包括：（1）空间蛋白质组学：将内侧膈肌条带（宽1–8 mm）包埋于OCT树脂，制备20 μm厚连续冷冻切片，单切片分别置于96孔板进行SP3法酶解，采用timsTOF Pro 2质谱仪以dia-PASEF模式进行11 min或21 min短梯度LC-MS分析，DIA-NN软件进行无文库检索定量；（2）生物信息学分析：基于滑动窗口（200 μm区域至少70%数据完整性）筛选和线性插补生成纵向蛋白表达谱，z-score标准化后定位NMJ和MTJ区域；（3）免疫组织化学与共染色：使用MYH亚型特异性抗体（BA-D5、SC71、BF-F3）结合FXYD6抗体进行肌纤维分型，α-BTX标记AChR，WGA标记突触基板，共聚焦显微镜成像；（4）免疫沉淀-质谱（IP-MS）：构建FLAG标签FXYD6过表达载体（C端和N端标签），在C2C12和SH-SY5Y细胞中表达，采用抗FLAG磁珠和抗FXYD6抗体进行内源与外源免疫沉淀，结合质谱鉴定相互作用蛋白；（5）原代成肌细胞分化体系与AChR聚集实验：分离小鼠原代成肌细胞，分化后转染FXYD6-FLAG，agrin刺激诱导AChR簇形成，评估FXYD6与AChR簇共定位。
**四、研究结果分述**
**1. 基于冷冻切片和短LC-MS梯度的膈肌骨骼肌空间蛋白质组解析**
研究人员以小鼠膈肌内侧肋区为模型，制备20 μm厚连续冷冻切片（从外周肋骨侧至中心腱膜侧），每切片单独酶解后进行11 min或21 min短梯度LC-MS分析，单切片平均鉴定约2500种蛋白质，四次重复实验累计鉴定超过6000种蛋白质。与先前比目鱼肌蛋白质组比较发现2408种蛋白质仅在膈肌中表达，反映两种肌肉间蛋白质表达的生理学和分子适应。基于肌球蛋白重链（myosin heavy chain, MYH）异构体分析证实膈肌主要含MYH2（IIa型）和MYH1（IIx型）肌纤维。纵向蛋白图谱显示肌节蛋白在肌区恒定表达并在MTJ处急剧下降，ECM蛋白在MTJ处显著升高。
**2. NMJ特异性蛋白表达谱揭示复杂神经肌肉结构**
AChE染色显示NMJ区域宽度在腹侧和背侧约200 μm至中间区域约600 μm之间。LC-MS分析检出突触前ChAT、突触间隙AChE和AChR亚基CHRND在同一NMJ区域表达。基于已知NMJ标志蛋白（神经丝蛋白、髓鞘蛋白、CHAT、ACHE）定义NMJ区域为?0.11至0.08相对单位，MTJ区域位于0.55以外。共鉴定出115种NMJ峰值蛋白、31种NMJ/MTJ双峰蛋白、92种MTJ峰值蛋白。突触囊泡相关蛋白（RAB35、STXBP1、VAT1）、髓鞘蛋白（periaxin、CNP、MAG）、神经元代谢蛋白（GLUT1、CKB、ENO2）均在NMJ呈现峰值。整合素α6和β4及层粘连蛋白α4（LAMA4）在NMJ处呈峰值表达。免疫荧光验证了DPYSL2定位于膈神经邻近BTX阳性区域，CPT1A在NMJ处呈最大表达。
**3. FXYD6在神经肌肉终板和骨骼肌纤维中的双重蛋白表达**
对7种ATPase亚型沿膈肌纵向轴的表达谱分析显示，ATP1A3和ATP1B3在NMJ处峰强度增加。免疫印迹确认FXYD6在脑组织中高表达，膈肌和比目鱼肌中表达相当且高于趾长伸肌。原代成肌细胞分化过程中FXYD6表达逐渐升高，同时ATP1A1、ATP1A2、ATP1B1和ATP1B2表达也随分化增加。免疫共染色证实FXYD6主要表达于MYH2阳性（IIa型）肌纤维，在比目鱼肌和腓肠肌中MYH2阳性纤维中FXYD6染色强度显著高于MYH7阳性纤维。FXYD6与BTX共定位显示其定位于NMJ质膜区域，与WGA共染在NMJ处显著重叠，提示FXYD6定位于富含糖蛋白的突触基板区域。AChR聚集实验证实agrin刺激后FXYD6与AChR簇共定位且染色强度明显增强，提示FXYD6可能参与突触后受体复合物的组织或稳定化。
**4. FXYD6与ATPase在神经和肌肉组织中的相互作用**
C2C12成肌细胞中FLAG-FXYD6免疫沉淀结合质谱鉴定出ATP1A1和ATP1B3为相互作用蛋白。C端FLAG标签构建体富集效率显著高于N端标签，提示N端修饰可能干扰蛋白正确折叠或定位。膈肌总裂解物中抗FXYD6免疫沉淀鉴定出与五种ATPase的相互作用。SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中FLAG-FXYD6鉴定出包括神经元ATP1A3亚型在内的多种ATPase亚基。脑组织中内源FXYD6免疫沉淀显示与骨骼肌相似的ATPase亚型互作模式。免疫共沉淀结合免疫印迹进一步证实脑和不同骨骼肌中FXYD6与ATP1A1的直接相互作用。
**五、讨论与结论**
研究人员将NMJ蛋白质图谱与单核RNA测序（snRNA-seq）数据进行比较，发现仅4种蛋白（ACHE、AChR、ANK3、FXYD6）在转录组和蛋白质组层面重叠，与施万细胞和终末施万细胞核基因簇比较发现额外10个基因重叠。这种有限重叠可能归因于突触结构包含转录组分析无法捕获的特化蛋白质微环境。PTGFRN与CD9在NMJ共同呈现峰值，可能参与稳定NMJ内细胞间接触。整合素α6β4异二聚体在NMJ峰表达，主要表达于施万细胞并与突触层粘连蛋白相互作用以增强施万细胞-ECM接触。AEBP1在NMJ处呈最大峰且定位于α-BTX阳性区域附近，可能与胶原相互作用并在组织修复中发挥作用，人类AEBP1突变与Ehlers-Danlos综合征相关，该类患者表现肌无力和疲劳，提示AEBP1在NMJ的表达可能有助于解释神经肌肉症状。
FXYD6作为FXYD家族成员，通过调节Na?/K?-ATPase对Na?和K?的亲和力，使细胞在活动后更有效地恢复离子梯度。研究揭示FXYD6在膈肌骨骼肌纤维质膜的先前未识别定位，提示其不仅可能在突触前发挥作用，还可能调节骨骼肌纤维突触后膜的Na?/K?-ATPase活性。FXYD6在IIa型肌纤维中的优势表达，结合这些纤维在氧化和糖酵解代谢中的灵活性，表明FXYD6通过微调ATPase活性维持离子梯度和收缩效率。
研究结论表明，空间蛋白质组学分析揭示了NMJ的复杂分子结构，包括突触囊泡机制、黏附蛋白和离子稳态调节因子。该数据集为理解呼吸功能和神经肌肉疾病的突触机制提供了全面分子图谱和新的研究方向。未来可采用单细胞蛋白质组学方法进一步阐明NMJ的细胞环境，包括终末施万细胞、邻近成纤维细胞和周围ECM。
