《Plant, Cell & Environment》：The Wild Soybean C3HC4-Type RING Zinc-Finger Protein ZFP4 Enhances Resistance to Soybean Mosaic Virus
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大豆[Glycine max (L.) Merr.]是全球重要的蛋白质和食用油来源，但受到大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)的严重威胁。野生大豆[Glycine soja Sieb. & Zucc.]作为栽培大豆的野生祖先，表现
大豆[Glycine max (L.) Merr.]是全球重要的蛋白质和食用油来源，但受到大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)的严重威胁。野生大豆[Glycine soja Sieb. & Zucc.]作为栽培大豆的野生祖先，表现出高度的遗传多样性和对病原菌的强大抗性。本研究从野生大豆中鉴定出一个新的SMV抗性位点RSC7?4及其候选基因ZFP4，该基因编码C3HC4型RING锌指蛋白。ZFP4的敲除突变体对SMV株系SC7和SC3表现出增强的感病性，而其过表达株系在不产生产量损失的情况下赋予抗性；ZFP4通过抑制GSTT1来增加谷胱甘肽含量并减少过量活性氧积累，从而介导抗性。驯化分析显示，栽培大豆中ZFP4的遗传多样性降低，且抗性单倍型ZFP4Hap1在育种中未被充分利用。总之，该研究不仅为SMV抗性大豆育种提供了优异的遗传资源，也为大豆对SMV抗性的调控机制提供了新的见解。
**一、研究背景与科学问题**
大豆[Glycine max (L.) Merr.]是全球重要的蛋白质和食用油来源，但大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病严重威胁大豆产量和品质。SMV属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，自然条件下可通过种子和蚜虫传播，化学防治效果不佳，因此挖掘和利用抗性基因是防控SMV最经济和有效的途径。野生大豆[Glycine soja Sieb. & Zucc.]作为栽培大豆的野生祖先，具有丰富的遗传多样性和优良的抗逆性状，是挖掘新抗性基因的重要种质资源。然而，长期人工选择导致栽培大豆遗传多样性显著降低，尤其在抗病相关位点上表现突出。目前已鉴定的SMV抗性位点如Rsv1、Rsv3、Rsv4等主要位于第2、13和14号染色体上，大多编码含核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列(nucleotide-binding domain leucine-rich repeat-containing, NLR)蛋白。然而，由于抗性种质遗传背景狭窄，许多潜在抗性位点难以被检测。因此，从具有广泛遗传多样性的野生大豆中发掘新的SMV抗性位点，并验证其抗病功能，对SMV抗性育种具有重要意义。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员以234份野生大豆为材料，在四个环境下对SMV强致病株系SC7的抗性进行了全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)，鉴定到一个新的抗性位点RSC7?4，并确定候选基因为ZFP4，其编码C3HC4型RING锌指蛋白。通过CRISPR/Cas9基因编辑获得zfp4、zfp6单突变体及zfp4 zfp6双突变体，同时构建ZFP4Hap1和ZFP4Hap2过表达株系，结合SMV接种鉴定、酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)、双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)、双荧光素酶报告系统和酵母单杂交(yeast one-hybrid, Y1H)等实验，系统研究了ZFP4调控SMV抗性的分子机制。结果表明，ZFP4通过抑制谷胱甘肽S-转移酶GSTT1的转录，提高谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量，清除过量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，从而增强大豆对SMV株系SC7和SC3的抗性，且不影响产量性状。驯化分析显示，抗性单倍型ZFP4Hap1在栽培大豆中频率极低，在全球育种中未被充分利用。
**三、主要关键技术方法**
本研究以234份野生大豆种质(主要来自中国北方、黄淮海和南方三大产区)为关联群体，在网室内对四个环境(E1: 2019年5月；E2: 2019年9月；E3: 2020年5月；E4: 2020年9月)进行SMV株系SC7抗性鉴定，采用多元线性混合模型(multivariate linear mixed model, MLMM)进行GWAS分析，结合连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)分析定位候选基因。利用CRISPR/Cas9技术以栽培大豆Jack为受体材料创制基因敲除突变体和过表达株系，采用Y2H、BiFC和Co-IP验证蛋白互作，运用GAL4/UAS和天然启动子驱动的双荧光素酶报告系统以及Y1H验证转录调控，通过商业试剂盒测定GSH含量和ROS浓度，并采用台盼蓝、3,3′-二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)和氮蓝四唑(nitroblue tetrazolium, NBT)染色检测细胞死亡和H2O2及O2?水平。此外，利用327份和1193份大豆种质资源进行单倍型和驯化分析。
**四、研究结果**
**2.1 野生大豆通过GWAS鉴定出SMV抗性位点RSC7?4**
对234份野生大豆在四个环境下的发病率(disease rate, DR)进行统计分析，平均DR值介于0.26至0.46之间，广义遗传力为51.73%，表明DR存在广泛的遗传变异。GWAS检测到第4号染色体上两个显著单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism, SNP)(rs04_48886352和rs04_48886587)在E2、E3和E4中稳定检测到，命名为RSC7?4，其效应值高于已知的Rsv3和Rsv4位点。结合LD分析将RSC7?4限定在32 kb区间，包含5个候选基因。
**2.2 RSC7?4候选基因ZFP4的鉴定**
SMV抗性种质NJAU_W052和感病种质HAAS_075接种SC7后，Glysoja.04G010500(即ZFP4)在抗性种质中8小时接种后(hpi)表达量较0 hpi升高约18倍，是唯一在所有时间点均显著上调的候选基因。该基因编码C3HC4型RING锌指蛋白。单倍型分析显示，ZFP4Hap1的DR显著低于其他单倍型，但仅13份野生大豆携带该单倍型。地理分布分析表明，在SC7流行的黄淮海地区，ZFP4Hap1和ZFP4Hap2各占38.5%，且该地区野生大豆DR显著低于北方和南方地区。对327份大豆的分析发现，所有219份栽培大豆均携带ZFP4Hap2。
**2.3 ZFP4增强大豆对SMV株系SC7和SC3的抗性且无生长代价**
对WT、6个敲除突变体和4个过表达株系接种SC7和SC3，结果显示zfp4 zfp6双突变体表现更严重的花叶症状和更高的DR，单突变体症状较轻，而ZFP4-OE株系DR显著低于WT。SMV外壳蛋白基因CP的表达量与症状程度一致。农艺性状调查表明，ZFP4对株高、主茎节数、单株荚数、单株粒数、百粒重和单株粒重均无显著影响。
**2.4 与ZFP4互作蛋白的鉴定**
亚细胞定位显示ZFP4Hap1和ZFP4Hap2均定位于细胞核。Y2H筛选获得与ZFP4Hap1互作的蛋白Glyma.05G207000，该蛋白编码谷胱甘肽S-转移酶THETA 1，命名为GSTT1。酵母回补实验、BiFC和Co-IP实验均证实ZFP4Hap1和ZFP4Hap2与GSTT1存在互作。
**2.5 GSTT1负调控大豆对SMV的抗性**
SMV接种后，ZFP4-OE株系中GSTT1表达显著低于WT，而突变体中显著上调。双荧光素酶报告实验表明ZFP4Hap1和ZFP4Hap2均具有转录抑制活性，且能显著抑制GSTT1启动子活性。Y1H实验证实ZFP4Hap1和ZFP4Hap2可结合GSTT1启动子上游1–100 bp区域。GSTT1-OE株系接种SC7和SC3后表现出更高的DR、更严重的花叶症状和更高的病毒积累量，表明GSTT1负调控大豆对SMV的抗性。
**2.6 ZFP4影响GSH和ROS的积累**
与WT相比，zfp4 zfp6突变体叶片中GSH含量显著降低，ROS浓度显著升高；ZFP4-OE株系则相反。台盼蓝染色显示突变体中出现大面积细胞死亡，而ZFP4-OE株系坏死较少。DAB和NBT染色结果表明，突变体中H2O2和O2?的积累水平显著高于WT，而ZFP4-OE株系中显著低于WT。
**2.7 ZFP4Hap1单倍型在大豆驯化过程中未被选择**
对1193份大豆(203份野生、472份地方品种、518份改良品种)的分析表明，ZFP4区域在野生、地方和改良大豆中Tajima's D值均为负值，核苷酸多样性(π)从野生大豆到改良大豆逐渐降低。ZFP4Hap1频率在野生大豆中为2.6%，在地方品种中降至0.4%，在改良品种中仅为0.2%，且在南美洲和北美洲的大豆种质中完全缺失。
**五、讨论与结论**
本研究通过GWAS从234份野生大豆中鉴定出新的SMV抗性位点RSC7?4，其效应值高于已报道的Rsv3和Rsv4位点。ZFP4Hap1在SC7流行的黄淮海地区富集，可能受到自然选择。研究提出的调控模型为：SMV侵染后，大豆免疫反应产生大量ROS，ZFP4通过抑制GSTT1转录维持GSH含量，GSH清除过量ROS，使细胞维持低氧化环境，从而表现抗病；而在zfp4 zfp6突变体中，GSTT1表达升高导致GSH消耗增加，ROS无法及时清除，细胞长期处于高氧化状态，表现为感病。该研究揭示了一条ZFP4-GSTT1-GSH/ROS调控大豆SMV抗性的新途径。由于ZFP4介导的抗性不伴随产量损失，且ZFP4Hap1可作为分子标记辅助选择的靶点，该基因具有重要育种应用价值。
研究结论：本研究鉴定了一个来自野生大豆的新的SMV抗性位点RSC7?4，其因果基因ZFP4编码锌指蛋白，通过调控GSTT1影响GSH和ROS含量，正向调控大豆对SMV的抗性。这些结果为大豆抗病育种提供了新基因，也为SMV抗性机制研究提供了新见解。
