漆酶模拟纳米酶（LLNs）在食品质量与安全监测中的结构-活性-应用框架：从仿生设计到智能传感平台

《Foods》：Effects of Colchicine Treatment on Bioactive Compounds and Structural Characteristics of the Epidermis and Cortex of Edible Cactus [Opuntia ficus-indica (L.) Mill.] Cladodes at Different Maturity Stages

　　

摘要专业翻译 漆酶模拟纳米酶（laccase-like nanozymes，LLNs）是一类受天然漆酶启发而发展的功能性纳米材料。凭借其优异的催化性能、结构可调性和卓越的稳定性，LLNs已成为食品质量与安全监测中极具前景的工具。本综述建立了一个关键的LLNs结构-活性-应用分析框架，将仿生设计与结构工程策略同活性位点调控、电子结构优化及催化微环境调节相关联，并最终与其在食品基质中的分析性能相衔接。综述深入阐述了LLNs如何与比色法（colorimetric）、荧光法（fluorometric）、电化学法（electrochemical）及多模式传感平台相整合。此外，重点强调了LLNs在食品质量监测中的应用，包括生物活性标志物检测、肉制品新鲜度监测、茶叶真伪与掺假分析以及其他质量相关参数的评估。在食品安全方面，特别关注了真菌毒素（mycotoxins）、农药和抗生素残留以及食品添加剂的高灵敏检测。尽管取得了上述进展，在催化机制与活性位点结构的阐明、标准化评价标准的建立以及复杂食品基质中选择性和可靠性的提升方面仍面临挑战。因此，未来研究应聚焦于理性活性位点工程、原位机理表征、标准化性能评估，以及将LLNs与多模式、便携式和智能化传感技术相整合，以推动其在食品分析中的实际应用。

论文主体内容学术总结

1. 引言

天然漆酶（laccases，EC 1.10.3.2）属于多铜氧化酶家族，能够催化酚类底物的氧化反应，以分子氧（O₂）作为最终电子受体并将其还原为水，无需外源H₂O₂参与。天然漆酶具有广泛的底物特异性，可氧化含羟基、胺基、羧基和甲氧基的多种芳香族化合物及其衍生物。然而，天然漆酶在实际应用中常受限于对环境条件的敏感性、高昂的生产成本以及回收再利用的困难。纳米酶的出现为开发稳健、可规模化且高效的生物催化替代方案开辟了新途径。自2015年首次报道具有漆酶样活性的含铜碳点以来，LLNs家族已迅速扩展至配位聚合物、金属有机框架（metal-organic frameworks，MOFs）、单原子纳米酶（single-atom nanozymes，SAzymes）及复合纳米材料等多种类型。与局限于蛋白质支架的天然漆酶相比，LLNs可通过多种合成和结构调控策略构建，赋予其广泛的组成和结构可调性。现有LLNs综述主要集中于铜基纳米酶及其在环境和生物医学领域的分析应用，而系统聚焦铜基和非铜基LLNs在食品质量与安全保障中应用的综述仍然有限。因此，本综述旨在弥合这一空白，整合现有知识，阐明LLNs结构、催化性质与食品分析性能之间的关系。

2. LLNs的设计策略与材料类型

2.1. LLNs的设计策略

LLNs的设计策略可分为仿生设计（bioinspired）和结构工程（structural engineering）两大类。仿生设计策略的核心在于模拟天然漆酶活性中心的微环境，包括Cu-N配位、三核铜簇（trinuclear copper cluster，TNC）以及His-Cys电子传递路径。研究人员已探索了多种仿生配体，包括天然氨基酸、非天然氨基酸、多肽和蛋白质等，作为铜离子的配位配体构建LLNs。含巯基配体（如谷胱甘肽）的引入可调控Cu⁺/Cu²⁺比例，模拟T1Cu位点的Cu-S配位。His-Cys二肽则被用于模拟His-Cys电子传递路径。结构工程设计策略则主要依赖合理的结构设计与电子结构调控来优化催化性能，包括缺陷工程（如氧空位构建）、电子结构工程（基于d带中心理论）、杂原子掺杂和异质结构构建等。缺陷工程通过调控配位环境、电子密度和表面吸附性能来增强漆酶样活性；电子结构工程则通过优化d带中心位置来调控中间体在催化表面的吸附强度；异质结构的形成可诱导内建电场，加速电子迁移并促进催化界面的氧活化。

2.2. 基于结构特征的材料类型

根据结构特征，已报道的LLNs可分为四大类：配位型、MOF基、单原子基和金属氧化物基LLNs。配位型LLNs以天然漆酶中明确的配位结构为蓝图，利用小分子配体（核苷酸、氨基酸、多肽、小分子化合物）或大分子配体（蛋白质、DNA、聚多巴胺）与金属离子配位构建。MOF基LLNs利用MOFs的高比表面积、可调孔隙率和可设计的化学环境，以金属节点作为内在催化位点，有机连接体可促进底物吸附并创造漆酶样微环境。双金属MOF基LLNs通常通过金属间协同作用优于单金属对应物。单原子基LLNs具有原子级分散的金属位点，最大化金属利用效率并暴露丰富的催化位点，通常以氮掺杂碳材料或MOFs作为载体锚定孤立金属原子，形成几何结构明确的M-N_x位点。金属氧化物基LLNs利用金属氧化物固有的电子转移和氧活化能力、丰富的表面化学性质以及混合价态阳离子来模拟天然漆酶，具有合成简便、稳定性高和活性可调等优势。四类材料各有优缺点，材料选择应依据目标分析物、食品基质、所需选择性、制备重现性和预期传感形式来决定。

3. 基于LLNs的传感模式

3.1. 比色模式传感

比色传感是LLNs检测策略中最早且最成熟的模式，通常基于2,4-二氯苯酚（2,4-dichlorophenol，2,4-DP）与4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine，4-AP）的氧化偶联显色体系。LLNs催化2,4-DP氧化为中间体，与4-AP偶联形成在510 nm处具有特征吸收峰的红色醌亚胺染料。该方法具有简单、快速、低成本且兼容便携式和高通量分析的优势。

3.2. 荧光模式传感

荧光检测在复杂生物和食品基质中通常表现出更高的灵敏度和准确性。LLNs基荧光传感通常利用非荧光底物邻苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）氧化为具有约560 nm荧光发射的2,3-二氨基吩嗪（2,3-diaminophenazine，DAP），DAP可通过荧光内滤效应（internal filtration effect，IFE）猝灭纳米酶自身的荧光。分析物浓度与比率荧光信号相关联，比率荧光策略通过内在自参考方式显著提高对环境波动和仪器波动的抗性。

3.3. 电化学模式传感

电化学模式传感具有高灵敏度、高可靠性和低成本的特点。LLNs基电化学传感通过催化氧化供电子分析物（如福美双、愈创木酚、槲皮素等酚类化合物），将化学氧化转化为可量化的电信号。LLNs可直接锚定在玻碳电极表面，通过循环伏安法（cyclic voltammetry，CV）、差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）、电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）和方波伏安法（square wave voltammetry，SWV）等技术获得可测量的电化学响应。

3.4. 传感器阵列模式

传感器阵列基于多个传感单元与目标分析物之间的差异化交叉响应原理，结合模式识别算法生成独特的多元指纹图谱，实现复杂基质环境中的可靠定性和半定量分析。基于单一LLN的多酶活性或多种LLNs的交叉响应，已开发出多种传感器阵列平台。为进一步提升传感灵敏度和检测性能，统计方法和机器学习算法（如人工神经网络（artificial neural network，ANN）、层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、K近邻（K-nearest neighbors，KNN）、线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）、随机森林（random forest，RF）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、支持向量机（support vector machine，SVM）和YOLOv8等）被整合到传感器阵列中。

3.5. 双模式/多模式

双模式或多模式整合的多读数分析策略相比单一检测模式具有显著优势，表现为增强的特异性、可靠性、适用性和更低的检测限。例如，基于Cu-BH纳米酶的双模式（比色和荧光）传感系统已被用于牛奶和蜂蜜中卡那霉素的检测。纳米酶催化还可与表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）整合，开发高灵敏传感平台。

4. LLNs在食品质量与安全传感中的应用

4.1. 食品质量

4.1.1. 生物活性化合物检测

食品基质含有丰富的生物活性成分，包括酚类化合物、黄酮类、绿原酸、白藜芦醇、槲皮素和抗坏血酸等。基于不同LLNs对酚类化合物的差异化漆酶样活性，多种比色传感器阵列已被构建用于复杂食品基质中酚类化合物的识别和区分。通过整合机器学习算法和智能手机成像分析，实现了饮料和蜂蜜样品中酚类化合物的快速智能化识别。此外，基于单原子Fe纳米酶和双金属LLNs的比色传感平台已被开发用于白兰地、白酒和茶饮料中单宁和鞣酸的定量检测。黄酮类化合物的检测通过仿生电化学生物传感器和基于多酶活性纳米酶的传感器阵列实现。抗坏血酸的定量检测则利用LLNs的漆酶模拟活性，通过显色体系的吸光度猝灭原理实现。

4.1.2. 感官缺陷物质

苹果汁和橙汁中高浓度的愈创木酚（>2 PPB）会导致异味产生，过量摄入存在肝肾毒性风险。基于CuN₄-G单原子铜LLN修饰的电化学传感器已被开发用于愈创木酚检测，检测范围为5至50,000 pM，检测限为1.2 pM。此外，LLNs已被广泛用于果汁澄清处理，通过降解酚类化合物来降低浊度并改善感官品质。

4.1.3. 食品新鲜度分类与预测

储存过程中，微生物代谢和氧化反应会产生挥发性腐败标志物。基于纳米酶的传感平台已推进了肉类新鲜度的快速检测，例如利用介质阻挡放电等离子体方法制备的MnZn双金属冷适应纳米酶可用于挥发性含硫化合物的原位监测和肉类新鲜度评估。

4.1.4. 茶叶分类与掺假/真伪鉴别

传感器阵列已被广泛用于复杂风味成分或标志物的识别。利用LLNs的差异化响应以及金属离子对其催化活性的调节作用，已开发出比色阵列用于不同产地茶叶盲样的准确识别。基于两种LLNs催化茶叶酚类化合物与4-AP显色反应的比色传感器阵列，结合随机森林算法，实现了六种关键茶多酚的100%准确判别，并成功识别了白牡丹茶五个水平的掺假样品。

4.2. 食品安全

4.2.1. 真菌毒素检测与消减

真菌毒素（如伏马菌素B₁（fumonisin B₁，FB₁）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁，AFB₁））是常见的食品污染物。基于真菌毒素对LLNs活性的特异性抑制或增强作用，多种比色传感器已被建立。例如，FB₁可特异性抑制Ag₃PO₄纳米颗粒的漆酶模拟活性，脱氧雪腐镰刀菌烯醇可增强FeCu纳米酶的漆酶样活性。在真菌毒素消减方面，Fe-SAzyme可将AFB₁催化转化为毒性较低的黄曲霉毒素Q₁（aflatoxin Q₁，AFQ₁），CuTA纳米酶对AFB₁的氧化降解率在9小时内可达78%。基于密度泛函理论（density functional theory，DFT）计算、分子动力学模拟和UPLC-MS结果，已提出三种AFB₁降解途径。

4.2.2. 农药残留

LLNs基农药检测主要采用五种机制：LLN活性调节、乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）介导识别与LLN活性调节、适配体识别与LLN活性调节、纳米酶联免疫吸附测定（nanozyme-linked immunosorbent assay，NLISA）以及多酶级联催化。多种LLNs已被开发用于福美双、草甘膦、有机磷农药和氨基甲酸酯类农药的检测。基于适配体调控的比色生物传感器已被构建用于马拉硫磷、高效氯氟氰菊酯和啶虫脒的高选择性检测。NLISA利用LLNs替代天然酶，相比传统ELISA灵敏度提高了150倍。多酶级联平台通过信号放大和中间体利用增强，实现了目标农药的灵敏选择性检测。

4.2.3. 抗生素残留检测与消除

基于抗生素对LLNs酶活性的抑制作用，多种比色传感器阵列已被建立用于多种抗生素的同时检测和区分。例如，基于Cu-BH纳米酶的漆酶活性和荧光特性建立了卡那霉素多模式检测策略；基于CeCo-MOF的比色传感器阵列可用于四环素类抗生素的检测。组氨酸工程被应用于增强Cu-BTC纳米酶的漆酶样活性，基于动力学分析的传感器阵列可区分九种β-内酰胺类抗生素。在抗生素消除方面，基于Ce⁴⁺/Ce³⁺的Ce-UiO-66和Ce-MOF-808 LLNs可高效降解四环素类抗生素，对多种抗生素的降解率超过80%，其机制为非自由基电子转移途径的氧化降解。

4.2.4. 食品添加剂

硫化物广泛用作食品防腐剂和风味调节剂。LLNs通过Cu-S键形成表现出硫化物增强活性，增强程度与S^2-浓度呈线性相关。基于GMP-Cu纳米酶的比色方法已被开发用于多种食品基质中硫化物的检测；基于不同硫化物对Cu₂(OH)₃NO₃催化的差异化调节作用，构建了可区分六种硫化物的纳米酶传感器阵列。此外，(+)-儿茶素和百里酚作为常用食品添加剂，其高浓度可引发健康风险，基于MI-Bpy-Cu和CuGaa的比色传感策略已被分别开发用于乳制品中(+)-儿茶素和蜂蜜中百里酚残留的检测。

4.2.5. 其他有害分析物

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是酒精饮料和发酵食品中常见的含氮有毒副产物，具有神经毒性和致癌性。为提高LLNs对EC的选择性，适配体和分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）等识别元件已被采用。基于适配体结合诱导立方Ag₂O纳米颗粒漆酶样活性增强的便携式比色试纸已被开发用于中国白酒中EC的检测；基于EC可切换的MIP包封漆酶样Cu-BH@MIP的现场荧光/比色双模式自校准检测方法也已建立。