无添加亚硝酸盐腌制盐的有机萨拉米香肠工业化生产：工艺设计与技术性能

《Foods》：Industrial-Scale Production of Additive-Free Organic Salami Without Nitrite Curing Salt: Process Design and Technological Performance

　　

摘要专业翻译 在发酵香肠中替代传统腌制剂在技术上具有很高的挑战性，尤其是在有机生产中，亚硝酸盐腌制盐（nitrite curing salt）不被允许使用。本研究验证了一种完全不含亚硝酸盐腌制盐及其他添加剂的有机萨拉米香肠（salami）的工业化生产工艺，并评估了其在家庭式加热过程中挥发性N-亚硝胺（volatile N-nitrosamines, VNAs）的形成情况。研究人员在标准化工业条件下，连续两年对20个生产批次进行了监测。从其中3个批次中采集样品，在加热前及分别于200 °C加热12 min和230 °C加热15 min后，采用气相色谱-热能分析仪（gas chromatography with thermal energy analysis, GC-TEA）对7种挥发性N-亚硝胺进行分析。发酵过程具有良好的可重复性，最终pH平均值为5.17 ± 0.18，年份间无显著差异。最终水分活度（water activity, aw）保持在0.90或以下（平均值0.881），证实脱水是决定性的栅栏因子。残留硝酸盐和亚硝酸盐含量保持较低水平，卫生指示菌计数较低；单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙门氏菌属（Salmonella spp.）及产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli）均未检出。所有亚硝胺在未加热的萨拉米香肠中及200 °C加热后均低于检测限；仅在剧烈加热条件下，N-亚硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine, NDMA）、N-亚硝基哌啶（N-nitrosopiperidine, NPIP）和N-亚硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine, NPYR）出现小幅增加，且仍处于毒理学非临界水平。就所研究的产品和条件而言，有机萨拉米香肠可以在不添加亚硝酸盐腌制盐的情况下，以工业规模安全且可重复地生产。

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一、研究背景与目的

亚硝酸盐腌制盐是传统发酵香肠生产的基石，其在色泽形成、风味稳定、抗氧化保护及微生物安全方面发挥着多重关键功能。然而，亚硝酸盐同时也是挥发性N-亚硝胺形成的关键前体物。挥发性N-亚硝胺是一类因致癌潜力而长期引发毒理学关注的化合物，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer, IARC）将其列为可能的人类致癌物。近年来，消费者对清洁标签（clean-label）肉制品的需求日益增强，即在配方中不含需要E-number标注的添加剂的产品。在有机食品领域，法规对腌制剂及其他添加剂的使用有着严格限制。然而，去除亚硝酸盐腌制盐对发酵香肠而言构成重大技术挑战：亚硝酸盐的缺失需要严格的工艺控制来弥补其直接的抗菌作用、色泽稳定功能和氧化保护功能。

已有研究提出了多种减少或替代传统腌制剂的策略，包括使用植物源硝酸盐以及精心设计的发酵和成熟方案。然而，这些方法可能引入残留硝酸盐和亚硝酸盐水平的变异性，并使色泽形成复杂化。在无亚硝酸盐发酵香肠中，微生物稳定性主要依赖于发酵期间的快速酸化以及成熟期间水分活度的降低。因此，当省略亚硝酸盐时，对温度、相对湿度、气流、质量损失和pH值的精确控制对于确保产品安全和技术一致性至关重要。此外，亚硝酸盐的缺失也改变了挥发性N-亚硝胺形成的潜在可能。尽管去除外加亚硝酸盐减少了亚硝化剂的可用性，但原料、香料或微生物代谢中仍可能产生微量硝酸盐或亚硝酸盐，在不利条件下仍存在挥发性N-亚硝胺形成的可能性。

热加工是影响挥发性N-亚硝胺形成的关键因素。虽然发酵香肠通常不经加热即食用，但消费者常见的烹饪方式如煎炸、烧烤或烤箱加热——特别是用作披萨配料时——可能使产品表面温度足以促进亚硝化反应。已有研究表明，挥发性N-亚硝胺浓度随温度升高和加热时间延长而增加，其中环状亚硝胺如N-亚硝基吡咯烷和N-亚硝基哌啶受影响尤为显著。

本研究旨在开发和验证一种不使用亚硝酸盐腌制盐或其他化学添加剂的有机萨拉米香肠的工业化生产工艺，并评估其技术与安全相关的结果。具体目标包括：在标准化工业条件下，利用化学和微生物指标评价发酵和成熟的稳定性；以及在现实和高温条件下，研究无添加剂、无亚硝酸盐有机萨拉米香肠在家庭式加热前后挥发性N-亚硝胺的潜在形成情况。本研究的独特贡献在于三个方面：在真正的工业规模上、跨20个批次和两个连续生产年份验证了完全标准化的工艺；在商业化而非中试工厂条件下证明了批次间的可重复性；以及在现实家庭加热条件下评估了挥发性N-亚硝胺的形成——这对于无亚硝酸盐发酵香肠而言鲜有报道。

二、研究内容与核心结论

研究人员开发了一种基于生物性硝酸盐还原的替代腌制工艺。该工艺的核心技术特征在于：不通过腌制盐添加亚硝酸盐，而是利用香料配方中选定的技术性配料提供确定的天然硝酸盐来源。这些成分由具有可重复硝酸盐含量的干燥蔬菜和香料来源配料组成，其定量配比经过精心调整，以提供足够的硝酸盐用于色泽形成，同时避免成品中过量残留硝酸盐或亚硝酸盐。在该替代腌制体系中，发酵剂培养物发挥着明确且工艺特异的功能：乳酸菌用于启动发酵并在早期加工阶段建立受控酸化；凝固酶阴性葡萄球菌，特别是肉糖葡萄球菌（Staphylococcus carnosus），主要利用其硝酸盐还原活性，在无亚硝酸盐腌制盐的条件下发挥替代腌制反应的核心作用。天然来源的硝酸盐在发酵和成熟早期被肉糖葡萄球菌的硝酸盐还原酶还原为亚硝酸盐，随后在肉基质的还原条件下进一步还原为一氧化氮（nitric oxide, NO）。这一过程由含针叶樱桃（acerola）成分中的L-抗坏血酸等还原剂促进。一氧化氮与肌红蛋白反应生成亚硝基肌红蛋白，从而实现稳定的腌制色泽形成。该替代腌制反应通过生物介导的硝酸盐-亚硝酸盐-一氧化氮序列进行，功能上等同于传统亚硝酸盐腌制，但无需添加亚硝酸盐腌制盐。亚硝酸盐在此体系中主要作为瞬时中间体而非残留化合物。

在栅栏技术设计方面，微生物稳定性并非通过腌制剂实现，而是通过有意识地应用栅栏原理，多个支持性栅栏依次作用。栅栏序列按时间顺序概括为：保护性发酵剂培养物的即时优势化；发酵期间快速酸化至pH < 5.0；受控的早期脱水（以约10%质量损失为标志）；以及最终脱水至低水分活度（通常≤0.90，约28%总质量损失时达到），为成品提供长期微生物稳定性。其中，水分活度的降低构成该工艺概念的关键安全屏障，而前期栅栏则弥补了亚硝酸盐在加工早期阶段缺失的抗菌作用。

三、关键技术与方法

本研究采用的主要关键技术方法包括：工业化规模的生产工艺验证，在德国图林根州弗兰肯海姆的商业干燥香肠工厂进行，连续两年各生产10个批次共20个全规模批次，原料为有机猪肉（来源于德国施韦比施哈尔农民生产者协会）；基于天然硝酸盐来源和硝酸盐还原性肉糖葡萄球菌的替代腌制体系；程序化气候控制系统实现精确的温度、相对湿度和气流调控；pH值采用校准的穿刺电极按ISO 2917测定；水分活度采用 chilled-mirror 露点水分活度仪（AQUALAB 4TE）在25 °C下测定；残留硝酸盐和亚硝酸盐按EN/DIN 12014-7光度法测定；挥发性N-亚硝胺由经ISO/IEC 17025认证的实验室采用气相色谱-热能分析仪（GC-TEA）按德国官方方法ASU L 00.00-17测定，检测限为<0.5 μg/kg；微生物分析采用ISO参考方法测定总活菌数、大肠杆菌、凝固酶阳性葡萄球菌、肠杆菌科、沙门氏菌属和单核细胞增生李斯特菌，并依据德国卫生与微生物学学会的指导值和警告值进行评价。

四、研究结果

4.1 pH值变化

最终产品pH值在两年间均集中在5.2左右。第一年pH值范围为5.0至5.6，平均值为5.20 ± 0.23；第二年范围为5.0至5.3，平均值为5.13 ± 0.11。全部20个批次的总体平均最终pH值为5.17 ± 0.18。统计检验显示年份间无显著差异（p > 0.05）。在预成熟约7天后，pH值已降至5.0以下，对应约10%质量损失；随后在成熟期间逐渐回升，在约28%质量损失时达到5.1–5.2。该结果表明在不使用亚硝酸盐腌制盐的条件下可实现可靠的pH管理。

4.2 水分活度

所有批次的最终水分活度均保持在0.90或以下。第一年范围为0.87至0.90，平均值为0.883；第二年范围为0.87至0.89，平均值为0.878。两年总体平均值为0.881（范围0.87–0.90，n = 20），大多数批次达到0.87或0.88。年份间无显著差异（p > 0.05）。该结果证实了目标水分活度降低在工业条件下可靠实现，确立了无亚硝酸盐腌制盐条件下持续微生物稳定性所需的关键屏障。

4.3 硝酸盐和亚硝酸盐浓度

所有样品中硝酸盐浓度范围为4至21 mg/kg，两年总体平均值为9.65 ± 3.73 mg/kg。第一年平均值为10.40 ± 4.97 mg/kg，第二年为8.90 ± 1.85 mg/kg。亚硝酸盐浓度同样较低：第一年范围为5至14 mg/kg，平均值为10.10 ± 2.73 mg/kg；第二年范围为4至12 mg/kg，平均值为8.70 ± 2.50 mg/kg。全部20个批次的平均残留亚硝酸盐浓度为9.40 ± 2.64 mg/kg。年份对硝酸盐或亚硝酸盐浓度均无显著影响（p > 0.05）。残留硝酸盐与亚硝酸盐之间未观察到显著相关性（Pearson相关，p > 0.05）。从毒理学角度看，以70 kg成人每日摄入250 g萨拉米计算，硝酸盐摄入量约2.5 mg/day，远低于世界卫生组织设定的每日可接受摄入量259 mg/day；亚硝酸盐平均浓度低于9 mg/kg，远低于欧盟法规规定的50–175 mg/kg上限。

4.4 微生物学分析

所有20个样品的微生物学状况良好。大肠杆菌在所有样品中均低于检测限（10 CFU/g）。肠杆菌科仅在低水平检出，范围为10至最高200 CFU/g。凝固酶阳性葡萄球菌浓度极低，计数为1至20 CFU/g。单核细胞增生李斯特菌在定量计数和25 g定性检测中均未检出。沙门氏菌属在所有样品中均未检出。产志贺毒素大肠杆菌（STEC/VTEC）的PCR筛查（靶向stx1和stx2基因）结果均为阴性。所有检出微生物计数均远低于发酵香肠的指导值和警告值，年份间无差异。

4.5 热加工后挥发性N-亚硝胺

在未加热的对照样品中，全部7种挥发性N-亚硝胺（NDMA、NDEA、NDPA、NDBA、NMOR、NPIP和NPYR）浓度均低于检测限（<0.5 μg/kg）。在200 °C加热12 min后，所有分析物的挥发性N-亚硝胺浓度仍低于检测限，与未加热对照相比无可见增加。在230 °C加热15 min的高温胁迫条件下，部分化合物出现小幅但可测量的增加：NDMA平均浓度为0.8 ± 0.2 μg/kg，NPIP为1.2 ± 0.3 μg/kg，NPYR为2.0 ± 0.4 μg/kg，而NDEA、NDPA、NDBA和NMOR在所有加热条件下均低于检测限。统计检验表明，NDMA在230 °C下的增加不显著，而NPIP和NPYR与对照及200 °C处理相比显著增加（p < 0.05）。所有分析物在代表典型家庭加热的条件下均低于检测限。

五、讨论与结论

讨论部分指出，研究结果证明无亚硝酸盐腌制盐的有机萨拉米香肠可在工业条件下生产，同时保持可靠的工艺控制和微生物安全。最终产品pH平均值5.17 ± 0.18且无显著年份效应，表明发酵性能稳健、终点控制一致。微生物学结果证实了栅栏策略的有效性：卫生指示菌保持低水平，相关病原体未检出。残留硝酸盐和亚硝酸盐浓度较低，表明亚硝酸盐主要作为短寿命中间体而非在基质中积累，这从质量和安全角度均属技术上的有利条件。有限的亚硝化剂可用性直接降低了储存或后续热处理期间亚硝胺形成的潜力。挥发性N-亚硝胺结果证明，在未加热状态和200 °C加热条件下均无可量化的挥发性N-亚硝胺，仅在230 °C高温胁迫下出现小幅增加且处于毒理学非临界水平，表明产品基质中的亚硝化潜力有限。

研究结论可概括为：本研究基于所测定的参数提供了证据，证明无添加剂有机萨拉米香肠可在工业规模上可靠生产，无需亚硝酸盐腌制盐，同时保持微生物安全和技术一致性。连续两个生产年份中，发酵和成熟产生稳定的最终pH值（平均值5.17 ± 0.18），无显著年份效应。残留硝酸盐和亚硝酸盐浓度保持在较低的两位数mg/kg范围内，未检出相关病原体，包括单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌属和产志贺毒素大肠杆菌。卫生指示菌持续处于低水平并符合适用指导值。在挥发性N-亚硝胺形成方面，基于3个独立生产批次和2种加热方案，所研究的无添加剂、无亚硝酸盐有机萨拉米香肠显示出极低的挥发性N-亚硝胺形成潜力。未加热产品或典型家庭制备条件（200 °C加热12 min）下均未检出挥发性亚硝胺。仅在严重过热条件（230 °C加热15 min）下，部分环状亚硝胺（NPIP和NPYR）出现小幅增加，而所有其他分析物仍低于检测限。即使在这些胁迫条件下，测得浓度仍较低且被认为毒理学非临界。该有利的亚硝胺特征直接归因于所采用的替代腌制策略，该策略使成品中残留亚硝酸盐水平较低，从而限制了亚硝化前体的可用性。总体而言，研究结果表明，无亚硝酸盐腌制盐的有机萨拉米香肠的工业化生产在技术上是可行的，所产产品兼具微生物安全、工艺稳健性和极低的亚硝胺形成潜力，为有机领域清洁标签发酵肉制品的进一步开发和工业实施提供了科学和技术基础。