《Foods》：Improvement of Ultrasound-Assisted Enzymatic Treatment and Exogenous Amino Acids on Structural, Antioxidant, and Instrumental Taste Profile of Maillard Reaction Products from Potato Protein Hydrolysates
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摘要专业翻译
由超声辅助酶解制备的马铃薯蛋白水解物（potato protein hydrolysates, PPHs）表现出较强的抗氧化活性。然而，其固有的苦味限制了其在食品领域的应用。为此，本研究考察了能量发散型超声（energy-divergent ul
摘要专业翻译
由超声辅助酶解制备的马铃薯蛋白水解物（potato protein hydrolysates, PPHs）表现出较强的抗氧化活性。然而，其固有的苦味限制了其在食品领域的应用。为此，本研究考察了能量发散型超声（energy-divergent ultrasound, EDU）和能量聚集型超声（energy-gathered ultrasound, EGU）辅助酶解处理以及外源氨基酸（丙氨酸（Ala）、苯丙氨酸（Phe）和缬氨酸（Val））对以PPHs为原料制备的美拉德反应产物（Maillard reaction products, MRPs）的肽结构、抗氧化活性及仪器味觉特征的影响。研究发现，EDU和EGU显著促进了美拉德反应（Maillard reaction, MR）的进程。与对应的PPHs相比，所有MRPs的肽结构均发生显著变化。在外源氨基酸等质量添加条件下，以Ala为外源氨基酸、经EDU辅助酶解并反应120 min制备的MRPs（EDU-Ala-120）具有最高的分子量（molecular weight, MW）<2 kDa组分占比（68.55%），其氧自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity, ORAC）值显著提升至108.44 μg trolox equivalent（TE）/mL。此外，EDU-MRPs表现出更强的鲜味和更低的苦味，而EGU-MRPs则呈现更强的甜味。相关性分析表明，苦味与咸味呈正相关（0.9465，p < 0.001），与鲜味呈负相关（?0.9517，p < 0.001）；酯类化合物与鲜味呈正相关（0.7293，p < 0.01），而MRPs的甜味与特定挥发性组分呈正相关，但与<1 kDa肽段呈负相关（?0.6039，p < 0.05）。因此，EDU辅助酶解结合添加适宜外源氨基酸的MR策略，有望成为制备兼具增强抗氧化活性的天然风味物质的一种前瞻性途径。
论文解读
一、研究背景与意义
马铃薯（Solanum tuberosum L.）是全球最重要的农作物之一，中国是全球最大的马铃薯生产国，产量约占全球的四分之一。马铃薯蛋白被视为高附加值的食品配料，但在马铃薯淀粉生产过程中，马铃薯蛋白往往随废液排放，未得到充分利用。马铃薯蛋白水解物（potato protein hydrolysates, PPHs）具有多种生物活性，包括抗氧化活性。然而，酶解过程中暴露和释放的疏水性氨基酸赋予抗氧化肽苦味，严重限制了其在食品工业中的大规模应用。美拉德反应（Maillard reaction, MR）是蛋白质、肽或氨基酸的氨基与还原糖的羰基之间发生的多种相互作用，可生成醛类、酮类、呋喃类、吡嗪类和吡咯类等多种风味化合物，能够掩蔽不良风味（如抗氧化肽的苦味），同时还可提升产物的抗氧化活性。为获得特征风味，可在MR体系中添加不同的外源氨基酸，如丙氨酸（Ala）、苯丙氨酸（Phe）和缬氨酸（Val），分别赋予花香、巧克力和焦糖风味。然而，外源氨基酸对马铃薯抗氧化肽来源的MRPs形成的影响此前尚不清楚。因此，开展本研究具有重要的理论意义和应用价值。
二、研究内容与主要结论
本研究旨在考察能量发散型超声（energy-divergent ultrasound, EDU）和能量聚集型超声（energy-gathered ultrasound, EGU）辅助酶解处理以及外源氨基酸（Ala、Phe和Val）对以PPHs为原料制备的MRPs的MR进程、肽结构、抗氧化活性、类黑精含量、游离氨基酸（free amino acids, FAAs）、仪器味觉特征和香气特征的影响，并进一步评估不同因素（肽结构、FAAs和香气特征）对仪器味觉特征的贡献。研究发现，EDU和EGU均显著促进了MR的进程。所有MRPs相较于其对应的PPHs在肽结构上均发生显著变化。在外源氨基酸等质量添加条件下，EDU-Ala-120在所有MRPs中具有最高的MW <2 kDa组分占比（68.55%）和最高的ORAC值（108.44 μg TE/mL）。EDU-MRPs表现出更强的鲜味和更低的苦味，而EGU-MRPs则呈现更强的甜味。相关性分析揭示了肽分子量分布、FAAs和香气化合物与仪器味觉特征之间的显著关联。该研究为利用EDU辅助酶解结合添加适宜外源氨基酸的MR策略制备兼具增强抗氧化活性的天然风味物质提供了科学依据。
三、主要关键技术方法
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：以马铃薯蛋白为原料，分别采用常规酶解（C）、EDU辅助酶解和EGU辅助酶解制备三种PPHs；将各PPHs分别与Ala、Phe或Val及木糖混合，在120 °C油浴中分别加热30、60、90和120 min制备MRPs；采用紫外-可见分光光度法测定褐变程度（294 nm和420 nm吸光度）；采用电子舌（electronic tongue）评价仪器味觉特征；采用荧光分光光度计测定内源荧光光谱；采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）分析肽结构；采用氧自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity, ORAC）法评价抗氧化活性；采用分光光度法测定类黑精含量；采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）测定分子量（molecular weight, MW）分布；采用氨基酸自动分析仪测定FAAs含量；采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace-solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS）分析挥发性化合物。
四、研究结果
pH值与褐变强度。 在120 min加热期间，pH值逐渐降低，294 nm和420 nm处吸光度随时间（30–120 min）严格递增，表明中间产物和晚期美拉德反应产物持续形成。在外源氨基酸等质量添加条件下，EGU-Val-120在所有MRPs中具有最高的A294和A420值。EDU和EGU处理的MRPs在294 nm和420 nm处吸光度均显著高于C-MRPs，表明超声处理促进了MR中间产物和最终产物的形成。
内源荧光。 所有MRPs的发射波长较PPHs发生红移（从422–426 nm移至435–458 nm），表明MR过程中生成了更复杂的荧光物质。在等质量外源氨基酸添加条件下，C-Ala-120在C-MRPs中荧光强度最高（58.92）；EGU-Phe-120（33.85）高于EGU-Ala-120（19.65）和EGU-Val-120（11.35）。EDU和EGU结合Ala或Phe的添加促进了MR进程和结构更复杂的MRPs的形成。
肽结构。 FTIR分析显示，MR后酰胺A带主峰从3286 cm?1移至3365 cm?1，归因于MR后肽的羟基O-H伸缩和酰胺A带N-H伸缩的形成。C-C、C-O、C-N区域及酰胺I、II、III带均发生位移变化，与MR过程中某些官能团（尤其是氨基酸中的–NH2）的损失有关。EDU-MRPs和EGU-MRPs在酰胺I和II区域呈现较弱的透射强度，表明羰基与氨基酸残基之间形成了共价键。超声可促进肽在MR过程中更高程度的交联。
分子量分布。 与C-PPH（57.55%）相比，EDU-PPH和EGU-PPH中MW <2 kDa组分占比分别显著增加至61.59%和66.58%。MR后，EDU-MRPs含有最高比例的MW <2 kDa组分（EDU-Ala-120为68.55%），而EGU-MRPs具有最多的MW >7 kDa组分（8.72%–12.34%），表明发生了更多的肽交联。在等质量氨基酸添加条件下，添加Ala的MRPs具有更多的MW <2 kDa组分。
游离氨基酸。 EDU-PPH和EGU-PPH的总游离氨基酸（total free amino acids, TFAA）含量（8.55和8.43 g/100 g）略高于C-PPH（8.33 g/100 g），但无显著差异。EDU-MRPs的TFAA含量显著低于C-MRPs，而EGU-Ala-120（16.39 g/100 g）和EGU-Val-120（16.07 g/100 g）的TFAA含量较高。这一现象可能归因于MR过程中发生的Strecker降解和氨基酸热降解。
ORAC与类黑精。 EDU-PPH和EGU-PPH的ORAC值（77.91和80.24 μg TE/mL）显著高于C-PPH（61.45 μg TE/mL）。MR后，EDU-MRPs和EGU-MRPs的ORAC值均强于C-MRPs。在等质量外源氨基酸添加条件下，EDU-MRPs表现出最高的ORAC值，其中EDU-Ala-120（108.44 μg TE/mL）在所有PPHs和MRPs中最高。含Ala的MRPs具有较高的类黑精含量，EDU-Ala-120（58.77 mmol/L）在所有MRPs中最高，与其高ORAC值一致。
芳香化合物。 在PPHs及其MRPs中共鉴定出143种挥发性化合物，包括24种醛类、42种酮类、13种酯类、20种醇类、6种酸类、5种呋喃类、9种吡嗪类、2种吡咯类、4种含硫化合物、5种烷烃、8种烯烃、1种亚胺和4种其他物质。与PPHs相比，所有MRPs的醛类含量均升高，其中EGU-Phe-120最高（65.80%）。苯甲醛是PPHs及其MRPs中的主要醛类，EDU-Phe-120（17.04%）、C-Phe-120（15.88%）和EGU-Phe-120（15.52%）的比例远高于其他MRPs。所有MRPs的总酮类含量均低于PPHs。含Ala的C-MRPs和EGU-MRPs的酯类比例高于含Phe和Val的MRPs。吡嗪类和吡咯类在所有MRPs中均被检出，但在PPHs中未被检出。EDU-Ala-120表现出最高的肉味二硫化物丰度。
仪器味觉特征。 所有PPHs均具有较高的苦味（6.7–9.9）和咸味（7.4–9.7），以及较低的甜味（4.3–6.6）、鲜味（2.7–5.2）和酸味（1.7–4.2）。其中EGU-PPH的苦味（9.9）和咸味（9.7）最高，鲜味（2.7）最低。随着不同外源氨基酸MR的进行，所有MRPs的苦味和咸味均降低，而甜味、鲜味和酸味均升高。C-Ala-120在C-MRPs中鲜味最高（7.6），C-Phe-120甜味最高（6.6）。EDU-Ala-120在EDU-MRPs中甜味最高（6.1）且苦味最低（3.3）。EGU-Ala-120在EGU-MRPs中甜味最高（8.5）且苦味最低（7.1）。添加Ala更有利于产生甜味较高的MRPs，而EDU比EGU更倾向于产生苦味较低的MRPs。
分子量分布、FAAs和香气化合物对仪器味觉特征的贡献。 苦味与咸味呈正相关（0.9465，p < 0.001），与鲜味（?0.9517，p < 0.001）和酸味（?0.6719，p < 0.05）呈负相关。1–2 kDa肽段与咸味（0.8078，p < 0.01）和苦味（0.7102，p < 0.01）呈正相关，与酸味（?0.7885，p < 0.01）和鲜味（?0.6729，p < 0.05）呈负相关。<1 kDa肽段与酸味（?0.7043，p < 0.05）和甜味（?0.6039，p < 0.05）呈负相关。TFAA与酸味呈正相关（0.9060，p < 0.001），与咸味呈负相关（?0.5917，p < 0.05）。酯类与鲜味（0.7293，p < 0.01）和酸味（0.6149，p < 0.05）呈正相关，与咸味（?0.7561，p < 0.01）和苦味（?0.6972，p < 0.05）呈负相关。甜味与己酸（0.6215，p < 0.05）、对伞花烃-7-醇（0.6141，p < 0.05）和2,2′-联呋喃（0.5971，p < 0.05）呈正相关。
五、讨论与结论
本研究表明，EDU和EGU辅助酶解处理马铃薯蛋白以及不同外源氨基酸对MR进程、肽结构、抗氧化活性和仪器味觉特征均有显著影响。EDU和EGU通过降低pH值、提高褐变程度和增强荧光强度促进了MR进程。EDU-MRPs表现出显著更强的鲜味和更低的苦味，而EGU-MRPs呈现更强的甜味。在外源氨基酸等质量添加条件下，EDU-Ala-120在所有MRPs中具有最高的MR中间产物水平、最多的MW <2 kDa组分和最高的ORAC值。因此，将EDU辅助酶解与添加适宜外源氨基酸的MR相结合，是一种极具前景的增强食品蛋白仪器味觉特征和抗氧化能力的技术。未来研究应纳入额外的对照体系，以区分肽美拉德反应、木糖-氨基酸反应和热降解各自的作用，从而提供更深入的机理见解。
