超声辅助酶解与外加氨基酸对马铃薯蛋白水解物美拉德反应产物肽结构、抗氧化活性及滋味特征的影响

《Foods》：Exploration of Milk and Dairy Products: Sensory, Physicochemical Characteristics and Processing Technologies

　　

由超声辅助酶解制备的马铃薯蛋白水解物（PPHs）表现出较强的抗氧化活性。然而，其固有的苦味限制了在食品领域的应用。因此，本研究探讨了能量发散超声（EDU）和能量聚集超声（EGU）辅助酶处理以及外源氨基酸（丙氨酸（Ala）、苯丙氨酸（Phe）和缬氨酸（Val））对由PPHs制备的美拉德反应产物（MRPs）的肽结构、抗氧化活性和仪器滋味特征的影响。研究发现，EDU和EGU显著促进了美拉德反应（MR）的进程。与对应的PPHs相比，所有MRPs在肽结构上均呈现出显著变化。在外源氨基酸等质量添加条件下，来自EDU与Ala反应120 min的MRPs（EDU-Ala-120）表现出最高的分子量（MW）<2 kDa组分比例（68.55%），以及显著提升的氧自由基吸收能力（ORAC）值（108.44 μg Trolox当量（TE）/mL）。此外，MRPs的苦味与盐味呈正相关（0.9465，p < 0.001），并与酯类物质呈正相关（0.7293，p < 0.01），而MRPs的甜味则与特定挥发性组分呈正相关，但与<1 kDa肽段呈负相关（-0.6039，p < 0.05）。因此，EDU辅助酶处理结合添加适当外源氨基酸的MR，可能是生产具有增强抗氧化活性的天然风味剂的一种前瞻性方法。

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研究背景与目的

马铃薯是全球重要的农作物之一，中国作为最大生产国贡献了全球四分之一的产量。马铃薯蛋白是一种高附加值食品原料，但在淀粉生产过程中常随废液排放而未被充分利用。马铃薯蛋白水解物（PPHs）具有多种生物活性，尤其是抗氧化活性。前期研究表明，能量发散超声（EDU）和能量聚集超声（EGU）辅助酶处理可增强马铃薯蛋白中潜在抗氧化肽的产生，并诱导肽链构象发生显著变化。然而，这些抗氧化肽固有的苦味成为其在食品工业中大规模应用的主要限制因素之一。美拉德反应（MR）可通过蛋白质、肽或氨基酸的氨基与还原糖羰基之间的相互作用产生醛、酮、呋喃、吡嗪、吡咯等多种风味化合物，从而掩盖抗氧化肽的苦味，同时还能提升产物的抗氧化活性。为了获得特征风味，可在MR体系中添加不同的外源氨基酸，例如丙氨酸（Ala）、苯丙氨酸（Phe）和缬氨酸（Val）分别赋予花香、巧克力和焦糖风味。目前，关于外源氨基酸如何影响马铃薯抗氧化肽衍生MRPs的形成尚不清楚。因此，本研究的目的是系统考察EDU和EGU辅助酶处理以及外源氨基酸（Ala、Phe、Val）对PPHs衍生MRPs的MR进程、肽结构、抗氧化活性、类黑精含量、游离氨基酸（FAAs）、仪器滋味特征及香气特征的影响，并评估不同因素对仪器滋味特征的贡献。

主要研究方法概述

研究人员采用以下关键技术方法：

1. 1.
   超声辅助酶解制备PPHs：将马铃薯蛋白溶液（3%，w/v）依次经Alcalase、Neutrase和Flavourzyme进行顺序酶解。酶解过程分别在三种模式下进行：常规水浴振荡（C组）、EDU组（53 kHz超声波清洗器，40 W/L）和EGU组（探头式超声波处理器，振幅2%，脉冲模式5秒开/5秒关，40 W/L），温度均维持在50°C。酶解后煮沸灭酶，离心取上清液冷冻干燥。
2. 2.
   MRPs制备：将PPHs、木糖和外源氨基酸（Ala、Phe或Val，等质量添加）混合于超纯水中，调节pH至7.4后在120°C油浴中加热不同时间（30、60、90、120 min）进行MR。
3. 3.
   理化性质与结构表征：包括褐变程度测定（A_{294 nm}和A_{420 nm}）、荧光光谱、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、分子量（MW）分布测定（高效液相色谱法，HPLC）。
4. 4.
   功能特性评价：采用氧自由基吸收能力（ORAC）法测定抗氧化活性；测定类黑精含量。
5. 5.
   风味分析：利用电子舌技术评价仪器滋味特征（苦、酸、甜、鲜、咸）；采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）分析挥发性化合物；测定游离氨基酸（FAAs）含量。
6. 6.
   统计分析：所有实验重复三次，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA）、Duncan多重比较检验和Pearson相关性分析。

研究结果

3.1 pH值与褐变强度

在整个120 min加热期间，所有MRPs的pH值持续下降，A_{294 nm}和A_{420 nm}吸光度随时间严格递增，表明中间产物和晚期美拉德反应产物持续形成。对于Ala组，EDU-Ala-120的A_{294 nm}（1.84）最高；对于Phe和Val组，EGU处理的A_{294 nm}最高。在A_{420 nm}方面，EGU-Val-120（0.82）在所有MRPs中最高。总体而言，EDU和EGU处理的MRPs比C-MRPs具有更高的A294 nm和A420 nm，表明超声促进了MR中间体和最终化合物的形成。研究指出，由于氨基酸是等质量而非等摩尔添加，因此氨基酸间的比较反映的是浓度与固有反应性的综合效应。}

3.2 内源荧光

所有MRPs相对于其PPHs前体均显示出更强的荧光强度，且发射波长从422-426 nm红移至435-458 nm，表明形成了更复杂的MRPs结构。在等质量添加下，C-Ala-120的荧光强度最高（58.92），而EGU-Phe-120（33.85）高于同组的其他样品。EDU和EGU处理结合Ala或Phe的添加促进了MR进程。

3.3 肽结构（FTIR）

FTIR分析显示，MR后酰胺A带主峰从3286 cm^-1位移至3365 cm^-1，归因于羟基O-H伸缩和N-H伸缩。C-C、C-O、C-N区域及酰胺I、II、III带也发生了位移，这与MR过程中官能团的损失和新生成（如Amadori重排产物中的C=O、吡嗪和Schiff碱中的C=N）有关。含Val的MRPs在2914-2939 cm^-1处的C-H伸缩吸收更强。EDU-和EGU-MRPs在酰胺A和B区（3380-3340 cm^-1）及酰胺I、II区的透过率强度降低，表明超声促进了更多共价交联的形成。

3.4 分子量（MW）分布

与C-PPH（57.55%）相比，EDU-PPH和EGU-PPH中MW <2 kDa组分的比例显著增加至61.59%和66.58%。MR后，EDU-MRPs含有最高的MW <2 kDa组分比例（EDU-Ala-120达68.55%），而EGU-MRPs则拥有最多的MW >7 kDa组分（EGU-Val-120达12.34%），表明EGU促进了更多的肽交联。在所有氨基酸中，添加Ala的MRPs产生了更多MW <2 kDa的组分。

3.5 游离氨基酸（FAAs）

EDU-PPH和EGU-PPH的总游离氨基酸（TFAA）含量略高于C-PPH，但无显著差异。MR后，EDU-MRPs的TFAA低于C-MRPs，而EGU-Ala-120（16.39 g/100 g）和EGU-Val-120（16.07 g/100 g）的TFAA较高，这可能与Strecker降解和热降解的动态平衡有关。

3.6 ORAC与类黑精

PPHs的ORAC值顺序为EGU-PPH（80.24 μg TE/mL）> EDU-PPH（77.91 μg TE/mL）> C-PPH（61.45 μg TE/mL）。MR后，所有MRPs的ORAC值均高于其对应的PPHs。在等质量添加外源氨基酸的MRPs中，EDU-MRPs表现出最高的ORAC值，其中EDU-Ala-120（108.44 μg TE/mL）在所有样品中最高。类黑精含量的趋势与ORAC一致，EDU-Ala-120的含量最高（58.77 mmol/L），表明高MW的类黑精是主要的抗氧化产物。

3.7 芳香化合物

在PPHs和MRPs中共鉴定出143种挥发性化合物，包括醛、酮、酯、醇、酸、呋喃、吡嗪、吡咯等。MR后总醛含量显著增加，其中EGU-Phe-120（65.80%）最高。苯甲醛（樱桃样香气）是主要醛类，在添加Phe的MRPs中含量更高。总酮含量在MR后降低。酯类（提供甜、花、果香）在含Ala的C-MRPs和EGU-MRPs中比例较高。吡嗪和吡咯（赋予烘烤和坚果风味）仅在MRPs中检出。二硫化物（肉香味）在EDU-Ala-120中丰度最高。

3.8 仪器滋味特征

所有PPHs均具有高苦味和咸味，低甜味、鲜味和酸味。EGU-PPH的苦味（9.9）和咸味（9.7）最高，鲜味（2.7）最低。MR后，所有MRPs的苦味和咸味降低，甜味、鲜味和酸味升高。对于C-MRPs，C-Ala-120鲜味最高（7.6），C-Phe-120甜味最高（6.6）。对于EDU-MRPs，EDU-Ala-120甜味最高（6.1），苦味最低（3.3）。对于EGU-MRPs，EGU-Ala-120甜味最高（8.5），苦味最低（7.1）。结果表明，添加Ala更有利于产生高甜度的MRPs，而EDU比EGU更倾向于产生苦味较低的MRPs。

3.9 MW分布、FAAs和香气化合物对仪器滋味特征的贡献

Pearson相关性分析显示：苦味与咸味呈极显著正相关（0.9465），与鲜味（-0.9517）和酸味（-0.6719）呈负相关。1-2 kDa肽段与咸味和苦味正相关，与酸味和鲜味负相关。<1 kDa肽段与酸味和甜味负相关。5-7 kDa肽段与酸味正相关。TFAA与酸味正相关（0.9060），与咸味负相关。酯类物质与鲜味（0.7293）和酸味正相关，与咸味和苦味负相关。特定的吡嗪类物质与苦味和咸味负相关，与鲜味正相关。甜味与己酸、p-伞花烃-7-醇和2,2'-联呋喃等特定化合物正相关。

讨论与结论

本研究证实，EDU和EGU辅助酶处理马铃薯蛋白以及添加不同外源氨基酸，对后续MR的进程、肽结构、抗氧化活性及仪器滋味特征均有显著影响。EDU和EGU通过降低pH值、提高褐变度和增强荧光强度，有效促进了MR的进行。在肽结构层面，超声处理促进了更多的共价交联，改变了二级结构。在抗氧化活性方面，EDU辅助酶解结合Ala添加所制备的MRPs（EDU-Ala-120）展现出最高的MW <2 kDa组分比例和最出色的ORAC值，这与其较高的类黑精含量密切相关。在风味改善方面，MR显著降低了原始PPHs的苦味和咸味，提升了甜味、鲜味和酸味。其中，EDU处理的MRPs鲜味更强、苦味更低，而EGU处理的MRPs甜味更突出。添加Ala普遍有利于产生更高甜度和抗氧化活性的MRPs。相关性分析揭示了肽段大小、游离氨基酸和特定挥发性化合物（如酯类和吡嗪类）与滋味特征之间的复杂关联。

研究结论：EDU和EGU辅助酶处理马铃薯蛋白及不同外源氨基酸对MR进程、肽结构、抗氧化活性和仪器滋味特征有显著影响。在等质量添加外源氨基酸的条件下，EDU-Ala-120在所有MRPs中显示出最高水平的MR中间产物、最多的MW <2 kDa组分以及最高的ORAC值。因此，将EDU辅助酶处理与添加适当外源氨基酸的MR相结合，是一种极具前景的提升食品蛋白仪器滋味特征和抗氧化能力的技术。未来的研究应包含额外的对照组（如仅含PPH和木糖的反应），以区分肽段MR、木糖-氨基酸反应和热降解各自的作用，从而提供更深入的机理见解。