《Cancers》：Circulating microRNAs at the Interface of Obesity and Breast Cancer: From Molecular Machinery, Diagnostic Potential, and Therapeutic Perspectives
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肥胖通过内分泌、炎症、代谢、基质和囊泡机制影响乳腺癌的风险、进展和治疗反应。循环及细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）相关的微小RNA（microRNA, miRNA）是有吸引力的液体活检候选标志物；然而，在肥胖相关乳腺癌中，不应将
肥胖通过内分泌、炎症、代谢、基质和囊泡机制影响乳腺癌的风险、进展和治疗反应。循环及细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）相关的微小RNA（microRNA, miRNA）是有吸引力的液体活检候选标志物；然而，在肥胖相关乳腺癌中，不应将其解释为仅来源于肿瘤的生物标志物。本叙述性综述将循环/EV-miRNA作为混合的宿主-肿瘤信号进行分析，并将基于关联的生物标志物证据与功能性EV介导的转移区分开来。研究人员对miRNA生物发生、循环miRNA转运、EV生物学、脂肪组织功能障碍、脂肪-肿瘤通讯、生物标志物开发、治疗反应和方法学报告标准等方面的研究进行了叙述性和整合性综述。现有文献沿着两个独立的轴进行解读：人类相关性与来源归因（从非乳腺模型到肥胖分层的人类队列），以及机制因果关系（从仅有关联到EV水平功能、miRNA水平功能以及带有挽救实验的因果关系）；临床验证被视为一个独立的限定条件，而非单一层级结构的顶端。例如，超重/肥胖乳腺癌患者中的EV-let-7a主要支持其作为肥胖分层的生物标志物候选。乳腺脂肪组织来源的EV货物中富含的miR-155-5p、miR-10a-3p和miR-30a-3p为代谢重编程提供了更强的功能支持，而EV相关的miR-221/222在内分泌抵抗方面具有中介水平的证据，但并非肥胖特异性。结论：本综述的主要贡献在于提出一个操作性解释框架，在该框架中，循环miRNA根据其可能的来源、证据等级和临床目的进行评估。未来的研究应报告EV工作流程质量、样本类型、溶血和血小板控制、标准化策略、外部验证、肿瘤亚型，以及超越身体质量指数（body mass index, BMI）的肥胖表型，包括腰围或腰臀比、胰岛素抵抗、糖尿病、绝经状态和炎症标志物。
论文主体内容总结
1. 引言
肥胖已成为乳腺癌风险、进展、治疗反应和生存期最重要的宿主相关修饰因素之一，尤其体现在绝经后女性中。其生物学影响不仅限于风险评估，还涉及炎症、内分泌紊乱、胰岛素抵抗、脂肪因子失衡、基质重塑及对肿瘤细胞的代谢支持。身体质量指数（BMI）应与腰围（WC）、腰臀比（WHR）、胰岛素抵抗、绝经状态和炎症标志物等更具信息量的代谢或人体测量指标共同解读。在此背景下，循环微小RNA（miRNAs）因其连接分子通讯与液体活检的特性而备受关注。本综述的核心创新在于将肥胖相关乳腺癌中的循环miRNA视为混合来源的宿主-肿瘤信号，而非单纯的肿瘤液体活检标志物，并区分了生物标志物类证据与功能性EV介导的转移证据。
2. 肥胖与乳腺癌：生物学与临床背景
肥胖是一种多因素疾病，其特征是脂肪组织过度积累以及内分泌、代谢和炎症稳态的深刻改变。在乳腺癌中，肥胖与风险的关联并不一致，取决于绝经状态和肿瘤亚型。肥胖通过多种相互关联的生物学机制与不良预后及降低的治疗反应性相关，包括芳香化酶介导的雌激素合成增加、胰岛素抵抗及高胰岛素血症、瘦素水平升高而脂联素水平降低，以及慢性低度炎症和氧化应激。这些因素汇聚于PI3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MAPK、NF-κB、HIF-1α等信号通路。此外，肥胖会深刻改变乳腺脂肪组织的生物学特性，使其转变为慢性炎症状态，其特征性组织学表现之一是乳腺冠样结构（CLS-B）的形成。这种功能失调的脂肪微环境可通过持续炎症信号、增强的雌激素产生、改变的脂肪因子分泌以及包含miRNA在内的调节性分子的细胞外囊泡（EV）介导转移来促进肿瘤发生。重要的是，许多这些过程调控着EV生物学和miRNA表达，表明肥胖可能独立于肿瘤负荷而显著影响循环miRNA谱。
3. 循环miRNA与细胞外囊泡的分子机制及其在肥胖与乳腺癌中的意义
大多数miRNA通过经典生物发生途径生成，最终形成RNA诱导沉默复合体（RISC）。此外，也存在如mirtrons等非经典途径。成熟miRNA可被主动输出到细胞外环境中，通过与EV、Argonaute蛋白或高密度脂蛋白（HDL）等保护性载体结合而保持稳定。EV，特别是外泌体，因其能保护miRNA免受降解并将其递送至受体细胞而备受关注。miRNA的选择性分选是一个高度调控的过程，涉及多种RNA结合蛋白（RBPs），如AGO2、hnRNPA2B1和YBX1，以及液-液相分离（LLPS）等机制。EV的生物发生始于内吞作用，经过多囊泡体（MVB）阶段，最终释放内含小泡。EV通过内吞作用、直接膜融合或表面信号传导等方式被受体细胞摄取。重要的是，并非所有细胞外miRNA都充当细胞内通讯的介质。在本综述中，循环miRNA在两个互补但不同的概念下被解读：作为反映肿瘤负荷或全身状态的生物标志物，以及作为功能性介质。为避免过度解读，证据沿两个独立轴分类：人类相关性与来源归因，以及机制因果关系，临床验证作为独立限定条件。
4. 肥胖脂肪组织作为循环和细胞外囊泡相关微RNA的来源
脂肪组织作为内分泌器官，能够向循环中释放EV和调节性miRNA，参与器官间通讯。一项里程碑式的研究证实，脂肪组织对循环中EV相关miRNA库有显著贡献。肥胖通过脂肪细胞肥大、慢性炎症、缺氧、基质重塑和代谢功能障碍等改变EV的产生、货物选择和生物活性。来自非乳腺癌代谢模型的间接证据表明，肥胖诱导的脂肪组织巨噬细胞和脂肪细胞来源的EV可通过转移特定miRNA来调节全身胰岛素敏感性和炎症。这对乳腺癌研究具有重要意义：肥胖患者的循环EV-miRNA可能整合了来自脂肪组织以及肿瘤、免疫、内皮、血小板等多个区室的信号。因此，不应在没有额外证据的情况下将循环EV-miRNA的变化解释为肿瘤特异性的。例如，血清EV相关let-7a在超重/肥胖乳腺癌患者中降低，并与BMI呈负相关，这支持其作为肥胖分层生物标志物的候选，但并未证明其脂肪来源或对肿瘤细胞的直接作用。
5. 细胞外囊泡相关微RNA在肥胖脂肪组织与乳腺肿瘤微环境交界处的作用
乳腺肿瘤微环境与周围脂肪组织紧密相连。除了可溶性介质外，EV为脂肪组织和乳腺癌细胞之间的分子货物交换提供了一种机制。基于人体组织的证据提供了最强有力的支持：来自超重或肥胖女性乳腺脂肪组织的EV可增加乳腺癌细胞的增殖、线粒体密度、氧化磷酸化相关基因表达和线粒体呼吸作用。这些EV富含miR-155-5p、miR-10a-3p和miR-30a-3p，其效应与Akt/mTOR/P70S6K信号相关。其他研究表明，脂肪细胞来源的EV与HIF-1α激活、生长、迁移、侵袭、上皮间质转化（EMT）和干细胞样表型有关。供体的代谢状态，而非单纯BMI，似乎决定了这些囊泡的生物学活性。总体而言，当前证据支持EV参与脂肪-肿瘤双向通讯，并有助于代谢适应、炎症重塑和侵袭等促肿瘤表型。然而，应区分完整EV的功能效应与单个EV相关miRNA的因果效应，前者证据更强。
6. 循环miRNA在乳腺癌中的诊断与预后潜力
循环miRNA已被广泛研究作为乳腺癌无创生物标志物。大规模队列研究表明，组合的血清miRNA面板可能改善早期检测。然而，诊断和预后miRNA特征需要外部验证才能实现临床转化。对于临床生物标志物解读，循环miRNA证据应使用标准化结构报告，包括样本类型、抗凝剂、溶血控制、血小板去除、RNA分离方法、标准化策略、检测平台、队列规模、肿瘤亚型、肥胖/代谢分层以及诊断或预后性能指标。这一点尤为重要，因为像miR-21和miR-155这样的miRNA并非默认具有肿瘤特异性，也可能反映炎症、免疫激活、基质重塑、血小板或内皮信号、糖尿病、药物暴露和肥胖相关的代谢功能障碍。
7. 循环miRNA及其在乳腺癌治疗反应中的意义
乳腺癌治疗耐药是一个多因素过程。miRNA可通过调节凋亡、自噬、DNA修复、EMT、干性、药物外排和免疫检查点等途径影响治疗反应。同时，EV可以在耐药和敏感细胞之间转移蛋白质、miRNA和其他调节性货物。内分泌耐药在肥胖相关乳腺癌中尤为相关，因为绝经后女性常见雌激素受体阳性肿瘤。小EV相关的miR-221/222是从他莫昔芬耐药细胞转移耐药性的一个例子，但这并非肥胖特异性。肥胖相关的循环小EV也可能通过宿主代谢调节来改变治疗反应。关键的概念区别在于肿瘤来源的EV介导的耐药转移与肥胖相关的宿主EV效应，保持这两种机制的分离可以防止过度解读。
8. 治疗前景：靶向肥胖与乳腺癌中的miRNA网络
基于miRNA的治疗提供了调节调控网络的可能性，主要包括恢复肿瘤抑制性miRNA和抑制致癌性miRNA两种策略。在乳腺癌中，这些方法仍主要处于临床前阶段。需要明确指出的是，目前尚无针对miRNA的干预措施在乳腺癌中得到临床验证，更未在肥胖相关乳腺癌这一特定临床情境中进行评估。在肥胖相关乳腺癌中，治疗框架不应只关注肿瘤细胞，更广泛的策略旨在中断脂肪-肿瘤通讯网络，包括减少脂肪炎症、恢复抑癌miRNA、抑制致癌或炎性miRNA、阻断病理性EV释放或摄取，以及破坏脂肪因子、HIF-1α和Akt/mTOR相关的代谢适应。EV本身也可被开发为治疗性RNA的递送载体，但仍需解决规模化生产、货物装载、生物分布和安全性等问题。此外，通过代谢干预（如减重、运动、饮食调整）间接调节循环和EV相关miRNA也是一种额外的治疗机会。
9. 方法学挑战与未来方向
循环和EV相关miRNA在肥胖相关乳腺癌中的临床转化仍受到方法学异质性以及区分肿瘤相关信号与宿主源性变化困难的限制。未来研究应优先关注样本处理、可靠的EV表征、适当的代谢表型分析、来源归因和独立验证。研究应报告详细的预分析条件、溶血和血小板污染评估、RNA提取程序和标准化策略。对于EV研究，应根据MISEV指南报告分离方法、颗粒浓度和大小分布、形态学或正交表征、阳性和阴性EV标志物以及潜在污染物评估。标准化仍是变异性的一大来源。BMI单独提供的信息不完整，未来研究应尽可能纳入WC、WHR、内脏和皮下肥胖、绝经状态、糖尿病或胰岛素抵抗、循环脂肪因子、炎症标志物、用药情况和治疗状态。大多数现有研究是横断面的，纵向采样将允许评估候选miRNA随疾病状态的变化。
10. 局限性
本综述为叙述性和整合性综述，而非系统综述或荟萃分析，因此不提供合并的诊断、预后或治疗效果估计。现有文献在样本类型、EV分离策略、miRNA检测平台、标准化方法、肥胖定义、代谢表型、肿瘤亚型和临床终点方面高度异质性。许多研究未能清晰区分总循环miRNA与EV相关miRNA，也未完全控制共分离的脂蛋白、Argonaute结合的miRNA、血小板来源物质、溶血和细胞死亡来源的RNA物种。此外，大部分将肥胖、EV-miRNA与乳腺癌联系起来的证据仍是临床前、关联性或基于小规模队列的，缺乏对单个miRNA作为因果介导者的功能验证。
11. 结论
循环和EV相关miRNA为理解肥胖相关乳腺癌提供了一个有用的框架，即将其视为一种宿主-肿瘤通讯过程，而非单纯的肿瘤现象。当前证据最好沿着人类相关性与来源归因以及机制因果关系这两个轴进行解读，而临床验证在这一情境中仍然有限。然而，其临床和生物学解读需要谨慎，因为循环miRNA信号可源自肿瘤、脂肪、免疫、内皮、血小板、基质或混合来源，并可受肥胖、代谢疾病、绝经状态、治疗暴露和预分析变异的影响。因此，未来研究应结合标准化的EV-miRNA工作流程、代谢表型分析、纵向采样、肿瘤亚型注释和功能验证。
