《Microorganisms》：Occurrence of Human Enteric Viruses in Retail Mussels Marketed in Burgos, Spain
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双壳类软体动物被认为是肠道病毒的生物蓄积体，因此是微生物污染的重要环境哨兵。这些生物的污染主要与沿海水域暴露于人类和农业废水有关，废水将病原体引入水生环境。由于双壳类动物的滤食活动，它们能够生物蓄积这些病原体，且因其常被生食或未充分烹煮食用，受污染的双壳类动物
双壳类软体动物被认为是肠道病毒的生物蓄积体，因此是微生物污染的重要环境哨兵。这些生物的污染主要与沿海水域暴露于人类和农业废水有关，废水将病原体引入水生环境。由于双壳类动物的滤食活动，它们能够生物蓄积这些病原体，且因其常被生食或未充分烹煮食用，受污染的双壳类动物可能构成公共卫生风险。甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）、戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）以及诺如病毒基因组I型和II型（norovirus genogroups I and II，NoV GI and NoV GII）被欧洲食品安全局和美国食品药品监督管理局认定为全球众多食源性暴发的主要病原学因子。食品中病毒污染缺乏既定的监管限量，推动了分子方法的发展，以产生科学证据并支持风险评估和控制策略。在此背景下，本研究旨在调查市售贻贝（Mytilus galloprovincialis）中HAV、HEV、NoV GI和NoV GII的检出情况。研究人员于2025年2月至12月及2026年1月至2月期间，从零售市场共采集78份混合样本，每份样本包含4至5只贻贝的消化组织，并采用逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR）进行分析。在5份混合样本中检测到NoV GII RNA，总体混合样本阳性率为6.4%（5/78；精确95%置信区间[CI]：2.1–14.3%），而HAV、HEV和NoV GI均未检出（0/78；精确95% CI：0.0–4.6%）。阳性混合样本中的RNA浓度较低，平均值为143.3 ± 132.4拷贝/克，中位数为120.0拷贝/克，循环阈值（cycle threshold，Ct）值与低水平RNA检出一致。总体而言，研究结果表明，市售净化贻贝中NoV GII的混合样本阳性率较低但可检出。零售贻贝中病毒RNA的检出表明其曾暴露于病毒污染，支持对市售双壳类动物持续开展病毒特异性监测的重要性。
论文解读
一、研究背景与研究意义
双壳类软体动物作为环境哨兵在海洋微生物污染监测中具有重要价值。这类生物营固着生活，通过滤食活动每天可处理超过4 L·h?1·g?1（干组织）的海水，因此能够高效富集水体中的化学污染物和微生物病原体，尤其是胃和消化腺等组织中的蓄积最为显著。贝类养殖区域的污染主要来源于人类粪便污染，包括点源排放、陆基径流、废水输入以及养殖区域附近船舶的废弃物排放。由于双壳类动物常被生食或仅轻度烹煮后食用，其组织内存在的病原体对公众健康构成潜在风险。
在欧盟监管框架内，活体双壳类软体动物的卫生与安全主要通过Regulation (EC) No 852/2004、Regulation (EC) No 853/2004和Regulation (EC) No 2073/2005进行规范，核心依赖于大肠杆菌（Escherichia coli）等粪便指示菌、沙门氏菌（Salmonella）等细菌性病原体以及海洋生物毒素的监测。然而，双壳类动物中病毒载量的常规监管标准和定量法定限量尚未建立，这凸显了开展额外监测数据以支持未来风险评估和监管决策的必要性。
甲型肝炎病毒（HAV）、戊型肝炎病毒（HEV）和诺如病毒基因组I型及II型（NoV GI和NoV GII）是食源性传播中最为关注的肠道病毒。既往研究显示，这些病毒在贻贝中的检出率存在显著差异，从完全未检出到较高阳性率不等。鉴于现有数据的高度异质性以及西班牙加利西亚产区市售净化贻贝中肠道病毒系统监测数据的缺乏，本研究旨在评估西班牙布尔戈斯市零售环节贻贝中HAV、HEV、NoV GI和NoV GII的检出情况，并考察采样月份和商业包装形式对检出率的影响。
二、研究设计与技术方法
研究人员于2025年2月至2026年2月期间，每月从西班牙布尔戈斯当地零售商店采购贻贝，每次采样获取6个不同商业单位（网袋包装、气调包装或散装），共收集78个商业单位，代表约312至390只个体贻贝。所有样本均为源自西班牙加利西亚的地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis），产品标签显示所有贻贝在零售前均经过净化处理。样本来自5家零售商店和9个可识别生产商，为保护商业机密，零售商店和生产商分别采用数字（1–5）和字母（A–I）代码匿名化处理。
病毒浓缩采用基于聚乙二醇（PEG）6000沉淀的方法，该方法改编自Lewis和Metcalf（1988）的方法，消化组织的混合策略遵循UNE-EN ISO 15216-1:2017标准。每份分析样本由4至5只贻贝的消化组织混合至2克。门戈病毒（Mengovirus，MgV）作为过程控制加入样本中。核酸提取使用QIAamp Viral RNA Mini Kit完成。病毒检测采用一步法逆转录定量PCR（RT-qPCR），对MgV及四种目标肠道病毒（NoV GI、NoV GII、HAV、HEV）进行定量检测。每个处理批次设置三个对照：样本过程控制（SPC）、阴性样本过程控制（NSPC）和提取控制（EC），以监测分析性能和潜在污染。MgV回收率低于5%的样本视为无效并需重新分析。抑制评估通过比较未稀释和1:10稀释RNA提取物的扩增结果进行，抑制水平≤75%视为可接受。阳性判定标准为两个技术重复均出现特征性S形扩增曲线且Ct值≤40。所有NoV GII阳性混合样本均在第二次独立RT-qPCR运行中进行技术重复再分析。统计分析采用Clopper–Pearson方法计算精确95%置信区间，使用Fisher精确检验评估NoV GII检出与商业包装形式或季节之间的关联，所有分析在R软件v4.5.3中完成。
三、研究结果
3.1 贻贝中肠道病毒的检出情况
共对78份贻贝混合样本进行了HEV、HAV、NoV GI和NoV GII四种肠道病毒的检测。HEV、HAV和NoV GI在所有样本中均未检出，各病毒靶标的混合样本阳性率为0.0%（0/78；精确95% CI：0.0–4.6%）。NoV GII在5份混合样本中检出，总体混合样本阳性率为6.4%（5/78；精确95% CI：2.1–14.3%）。所有NoV GII阳性混合样本均于2025年采集，其中4月检出1份阳性，5月和11月各检出2份阳性。4月月度阳性率为16.7%（1/6），5月和11月均为33.3%（2/6）。其余月份均未检出NoV GII。
3.2 季节和商业包装形式的分布
5份NoV GII阳性混合样本中，3份在春季采集，季节阳性率为16.7%（3/18；95% CI：3.6–41.4）；2份在秋季采集，阳性率为11.1%（2/18；95% CI：1.4–34.7）。冬季和夏季均未检出NoV GII。季节与病毒检出之间的关联未达到统计学显著水平（Fisher精确检验，p = 0.0648）。在商业包装形式方面，5份阳性样本中4份来自网袋包装贻贝，1份来自气调包装贻贝，网袋包装阳性率为10.3%（4/39），气调包装为2.9%（1/34），散装样本为0.0%（0/5）。商业包装形式与NoV GII检出之间未观察到统计学显著关联（Fisher精确检验，p = 0.5471）。2025年采样期间阳性率为7.6%（5/66），2026年1月和2月采集的12份样本均为阴性。
3.3 分析性能与NoV GII RNA浓度
对照病毒平均回收率为42.9%，50.0%的样本回收率为可接受水平（5–25%），21.8%为良好水平（25–50%），28.2%为很好水平（>50%）。RT-qPCR抑制范围为0至41.8%，仅一份7月采集的样本超过阈值，抑制率达99.1%，该样本采用1:10稀释RNA提取物进行结果判读。所有78份样本的MgV回收率均高于5%，无需重新处理。5份NoV GII阳性样本在第二次独立RT-qPCR运行中均重现阳性结果。NoV GII的检出限（LOD）为3.45拷贝/反应，定量限（LOQ）为8.2基因组拷贝/克。5份阳性样本的Ct值范围为35.2至37.7，平均值为36.7 ± 1.0，中位数为36.6；病毒RNA浓度范围为48.7至372.2基因组拷贝/克，平均值为143.3 ± 132.4拷贝/克，中位数为120.0拷贝/克。
四、讨论总结与结论翻译
讨论部分总结：
本研究提供了来自加利西亚产区、在西班牙布尔戈斯市销售的零售环节地中海贻贝中四种重要肠道病毒检出情况的数据。研究设计反映的是经过捕捞、净化、加工和分销后最终面向消费者的产品中的病毒污染状况，而非环境污染压力或特定污染源。NoV GII是唯一检出的病毒靶标，总体阳性率为6.4%，处于既往零售层面研究报告的高度异质性范围内。与西班牙及欧洲其他研究相比，本研究的阳性率相对较低，可能归因于采样阶段（零售净化产品vs.收获区域直接采集）、物种组成、净化状态、分析程序（包括混合策略、Ct判定阈值、核酸提取和扩增方案）以及病毒循环的时间差异等多重因素的综合作用。NoV GII而非NoV GI的检出可能主要反映两种基因群在人群中的流行病学循环差异，西班牙废水监测研究显示NoV GII的阳性率普遍高于NoV GI。季节分析虽未达统计学显著，但春季阳性率较高，与西班牙部分地区的研究发现一致。商业包装形式方面，网袋包装中检出频率较高，但缺乏统计学显著性，且气调包装对RNA稳定性的潜在影响机制尚不明确。所有阳性样本均来自标注为已净化的零售产品，这与诺如病毒在双壳类消化组织中通过组织血型抗原（HBGA）样碳水化合物配体特异性结合而持续存在的已知特性一致。研究局限性包括RT-qPCR无法确定病毒传染性、高Ct值表明低水平RNA检出、缺乏净化前后对比数据以及缺乏加利西亚特定收获区域的废水监测数据。低水平NoV RNA检出既不应被解读为风险可忽略，也不应被视为存在感染剂量，而是表明贻贝在生产分销链的某个环节曾暴露于病毒污染。
结论翻译：
在分析的78份零售地中海贻贝混合样本中，5份检出NoV GII RNA，总体混合样本阳性率为6.4%，而HAV、HEV和NoV GI均未检出。本研究为源自加利西亚、在西班牙布尔戈斯市销售的净化零售贻贝中肠道病毒的检出情况提供了基线数据。结果表明NoV GII RNA呈散发性低水平检出，未发现明确的季节性模式或商业包装形式相关规律。
