《Microorganisms》：In Vitro Screening of Short Synthetic Antimicrobial Peptides Toward Food-Relevant Microorganisms: Antifungal Activity and Molecular Docking Analysis
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食品腐败和食源性微生物仍然是食品安全与保藏面临的主要挑战，这促使人们寻找适用于最小化加工和清洁标签产品的替代抗菌剂。本研究评估了六种含精氨酸或同时含赖氨酸和精氨酸残基的短合成肽，作为针对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肠道沙门氏菌
食品腐败和食源性微生物仍然是食品安全与保藏面临的主要挑战，这促使人们寻找适用于最小化加工和清洁标签产品的替代抗菌剂。本研究评估了六种含精氨酸或同时含赖氨酸和精氨酸残基的短合成肽，作为针对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）和白色念珠菌（Candida albicans）的潜在抗菌剂。通过肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），并针对白色念珠菌羊毛甾醇14α-脱甲基酶进行分子对接，以提供分子层面的见解。在所测试的浓度范围内，所有肽均未抑制肠道沙门氏菌，表明其对革兰氏阴性菌的活性有限。肽1、3、5和6仅在相对较高的浓度下抑制金黄色葡萄球菌，MIC值介于1598.7至1782.0 μmol L?1之间，且未确认具有杀菌活性。相比之下，肽4（FEFKFEFKGGGRGDS）是唯一对白色念珠菌具有活性的序列，MIC为19.93 μmol L?1。然而，在所测试的浓度范围内未获得最小杀菌浓度（minimum fungicidal concentration，MFC），表明观察到的抗真菌效应应被解释为抑菌作用而非确认的杀菌活性。对接分析与这一实验趋势一致，肽4表现出最优的预测结合能（?8.4 kcal mol?1），并与ERG11催化位点建立了预测接触，包括Lys143、Arg381、His468、Arg469和Cys470。这些发现表明，抗菌活性强烈依赖于序列和微生物种类。肽4代表了有前景的抗真菌先导序列，可在食品相关系统中进一步优化和验证。
论文解读
一、研究背景与目的
食品腐败和食源性疾病是全球食品工业、公共卫生体系和食品供应链面临的持续性重大挑战。微生物污染可发生在生产、加工、储存、流通和消费的各个环节，不仅造成经济损失，更对消费者健康构成严重威胁。传统食品保藏方法包括干燥、冷冻、热处理、辐照、真空包装、气调包装、罐藏以及添加化学防腐剂等，虽然广泛应用，但部分传统加工方式可能影响食品营养品质、引发不良化学变化或改变消费者感官认知，尤其当合成添加剂以较高浓度使用时更为突出。近年来，消费者对最小化加工食品、清洁标签成分和少含人工添加剂产品的需求持续增长，推动了替代抗菌剂的研发。
在此背景下，生物活性肽因其结构多样性、生物活性和与食品基质的潜在相容性而成为食品保藏领域备受关注的候选物质。抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）通常具有短氨基酸序列、净正电荷和两亲性结构，可通过阳离子残基与微生物细胞表面负电荷组分之间的静电相互作用实现选择性结合，随后疏水残基促进肽插入脂质双层，导致膜失稳、通透性增加、孔道形成和胞质内容物泄漏，最终引起细胞死亡。然而，短合成抗菌肽的实际应用仍受多种技术挑战制约，包括对某些微生物的抑菌浓度偏高、在复杂食品基质中活性或稳定性下降等，因此需要对候选序列进行系统筛选和比较评估。
本研究选取六种此前已报道的短合成肽，针对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌肠道沙门氏菌和酵母样真菌白色念珠菌进行抗菌活性比较评估，旨在识别序列依赖性抗菌趋势，并将这些响应与选定的理化性质相关联。同时，采用分子对接技术研究候选肽与白色念珠菌羊毛甾醇14α-脱甲基酶（ERG11）的预测相互作用模式，以补充解释观察到的抗真菌活性。三种目标微生物具有截然不同的细胞包膜结构，为评估肽类对不同生物屏障的活性谱和可能的构效关系提供了重要信息。
二、主要技术方法
研究人员采用肉汤微量稀释法测定六种短合成肽对三种食品相关微生物的最小抑菌浓度（MIC），并使用PrestoBlue?细胞活力试剂进行终点判定。从MIC测定中未见可见微生物生长的孔中取样转接至琼脂平板，以确定最小杀菌浓度（MBC）和最小杀菌浓度（MFC）。分子对接分析采用AutoDock Vina 1.1.2程序，以AlphaFold预测的白色念珠菌ERG11三维结构（UniProt登录号P10613，全局pLDDT评分95.21）为受体，采用盲对接策略，网格盒中心坐标为x = 1.038、y = 3.324、z = ?1.401 ?，尺寸为126 × 126 × 126 ?， exhaustiveness参数设为100，每个肽生成10个构象。肽的三维结构由AlphaFold/ColabFold根据氨基酸序列生成。
三、研究结果
3.1 短合成肽对食品相关微生物的抗菌活性
六种肽的抗菌响应强烈依赖于肽序列和目标微生物种类。所有肽在测试浓度范围内均未抑制肠道沙门氏菌的生长，表明该革兰氏阴性菌对测试序列具有抗性，这与其外膜含脂多糖形成的通透性屏障有关。肽1、3、5和6仅在相对较高浓度下抑制金黄色葡萄球菌，MIC值介于1598.7至1782.0 μmol L?1之间，且未能在测试范围内确定MBC，说明这些肽虽可抑制可见生长但无法杀灭99.9%的细菌群体。肽2和肽4在评估范围内未抑制金黄色葡萄球菌。肽2（FEFR）作为最短序列，对所有测试微生物均无活性，其极短序列可能限制了两亲性结构的形成和多重相互作用的建立。相比之下，肽4（FEFKFEFKGGGRGDS）是唯一对白色念珠菌显示相关活性的序列，MIC为19.93 μmol L?1，但未在测试范围内获得MFC，因此其活性应解释为抑菌而非确认的杀菌作用。肽4的GGGRGDS延伸段中甘氨酸富集区可能增加骨架柔性，RGD基序引入额外极性和带电残基，可能促进与真菌表面组分或蛋白结合区域的适应。序列理化性质分析显示，测试肽中谷氨酸残基的反复出现降低了整体阳离子密度，可能削弱与负电荷细菌膜的初始静电吸引。
3.2 针对白色念珠菌靶标的分子对接分析
分子对接结果显示，肽4在六种肽中获得最低的AutoDock Vina对接评分（?8.4 kcal mol?1），其次为肽6（?7.8 kcal mol?1）。然而，由于肽长度从4到15个氨基酸不等，直接比较绝对结合分数可能受配体大小影响，因此Vina分数被解释为预测肽–ERG11适配性的比较指标而非定量结合亲和力。肽4与ERG11多个功能相关残基建立了预测接触，包括Lys143、Arg381、His468、Arg469和Cys470。其中与Cys470的接触尤为值得关注，因为该保守残基是CYP51酶中血红素铁的轴向配体，但由于对接模型中未包含血红素辅因子，该相互作用应被解释为与血红素结合区域蛋白环境的预测接触。肽5和肽6也显示与Cys470的预测疏水接触，但肽4的独特之处在于建立了涉及多个功能相关残基的更广泛相互作用网络。肽6虽然获得第二低的对接评分，但未在测试浓度范围内抑制白色念珠菌，这反映了对接评估的是配体与分离受体的预测相互作用，而体外抗菌活性还涉及溶解度、稳定性、细胞表面相互作用、包膜穿越等一系列额外事件。
四、讨论与结论
讨论部分指出，测试肽对金黄色葡萄球菌的较弱活性与其理化性质有关。经典抗菌肽通常需要正净电荷、足够疏水性和两亲性组织的组合，而测试序列中谷氨酸残基反复出现降低了阳离子密度，可能削弱了与细菌膜的静电吸引。与文献中高效肽如1018-K6（对肠道沙门氏菌MIC为8–64 μg mL?1）和KRR-N1-5W6L（对肠道沙门氏菌MIC为32 μM）相比，测试肽的电荷分布和两亲性组织优化不足。肽4对白色念珠菌的选择性活性提示其序列可能优先与真菌细胞结构相互作用而非细菌包膜。分子对接作为探索性计算方法，为肽4的选择性抗真菌活性提供了初步分子层面的解释，但所提出的作用模式仍需通过专门实验研究验证。未来研究应从肽的表征和优化逐步推进至应用导向的验证，包括确认肽的同一性、纯度、结构行为、抗蛋白酶解稳定性和安全性，评估杀菌活性、膜通透化、时间依赖性杀灭及ERG11和麦角固醇相关通路的可能参与，最终在食品模拟系统和模型食品基质中评估稳定性、抗菌性能、配方相容性和实际适用性。
