小鼠皮层深层稀疏兴奋性神经元类型的时空发育

《iScience》：Spatiotemporal development of sparse excitatory neuronal types within the deep mouse cortex

　　

**亮点**

• 超过150万个脑细胞映射了关键发育阶段的细胞类型发育过程
• 单细胞空间转录组学揭示了皮层细胞成熟模式
• 底板和纹状体呈现出不同的时空发育特征
• 底板和纹状体包含转录组学上不同的神经元亚型

**摘要**

揭示细胞类型发育的时空组织对于理解皮层模式形成和功能至关重要。为绘制发育中小鼠脑细胞类型的时程演化和空间模式，我们在此利用单细胞空间转录组学，跨越四个发育时间点及两种性别进行了研究。我们生成了一个包含胚胎期和出生后多个时间点超过150万个脑细胞的数据集，并重点研究了底板和纹状体的深部皮层神经元，这些神经元通常被认为由于成体中共享的分子特性而具有相似的发育模式。我们发现发育中的底板和纹状体存在显著差异，包括不同的起源、转录组学演化和时空成熟过程，表明这些神经元可能在发育中发挥关键但不同的作用。我们的单细胞空间转录组学数据集涵盖多个时间点和性别的多种细胞类型，将有助于未来对脑发育中细胞类型的研究。

**图形摘要**

**引言**

发育中的大脑包含多种细胞类型，它们以严格调控的时空方式产生。这些细胞类型背后的发育过程由复杂的转录程序和信号通路协同调控，引导细胞命运和成熟。理解不同细胞类型在发育过程中如何产生，对于阐明健康脑发育的机制以及识别可能在神经发育障碍中被破坏的信号通路至关重要。尽管这一点很重要，但细胞类型通常出现并开始向最终目的地迁移的早期胚胎发育窗口仍未得到充分探索。

单细胞和空间分辨率对于评估具有独特空间定位并在神经发育中发挥关键作用的稀疏细胞群体尤为重要，而这两者正是深部皮层中特定类型神经元的标志。其中最突出的例子就是底板（SP），这是一个短暂且异质的神经元群体，在神经元群体迁移入皮质板的过程中发挥着至关重要的作用。SP神经元是神经发生中最早出生的之一，大约在胚胎第10.5至13.5天（E10.5–E13.5）出现，并通过预板分裂促成皮层层面的形成。它们通过短暂的突触连接促进神经元迁移和早期网络形成，其中一部分SP神经元会持续存在于成体中，成为第6b层（L6b）神经元，研究表明其参与脑状态调节和觉醒调控。

在深部皮层中与SP空间相邻的是纹状体复合体（CLA），这是一个进化上保守的结构，在大脑皮层和纹状体之间形成一层薄薄的神经元片。与SP神经元类似，CLA神经元也在类似的时间窗口内于皮质脑室区出生，并据认为通过侧皮质流迁移，在E15至E19左右到达最终目的地。尽管对CLA在发育中的功能知之甚少，但在成体中，它既参与与L6b共享的功能，也参与不同的功能，这两种细胞类型均涉及睡眠、意识、注意、显著性和记忆。

SP和CLA共享空间模式、分子特性、时程进程和行为贡献，提示它们可能存在发育关系。先前的研究为SP发育及其与CLA的潜在联系提供了基础性见解，鉴定了从胚胎到出生后阶段的关键标记基因和时间依赖性表达模式。然而，这些研究主要依赖一组固定数量的标记基因，且在发育匹配的时间点缺乏单细胞或空间分辨率，使得难以解析SP和CLA内部及之间分子异质性或发育进程。因此，阐明这些细胞群体的时间模式对于解决SP和CLA如何在发育中的皮层中产生至关重要。

在此，我们对发育中的小鼠脑进行了单细胞空间转录组学分析，跨越E12.5、E15.5、E18.5和出生后第1天（P1）四个时间点，同时包括雄性和小鼠。通过这一过程，我们在四个时间点空间映射了超过150万个脑细胞。我们利用该数据集详细研究了发育中脑细胞类型的时空进程，包括SP和CLA群体。我们的工作揭示了SP和CLA群体的时空分化，表明它们可能调控神经发育的不同方面。我们的发现为这些深部皮层结构如何在神经发育过程中从转录组学上产生和多样化提供了新的见解。为了方便探索该数据集，我们开发了一个交互式门户网站CellestialCortex（https://developingbrainatlas-cellestialcortex.com/），使用户能够可视化和探索发育中的皮层细胞类型。我们的数据集和门户网站补充并拓展了近期生成小鼠脑中发育细胞类型综合图谱的努力，提供了一个在空间背景下具有单细胞分辨率的早期胚胎数据集。

**结果**

单细胞空间转录组学捕获了发育中大脑的主要细胞类型

为了解发育中小鼠脑的转录组学谱，我们在四个发育阶段（E12.5、E15.5、E18.5和P1）的雄性和雌性小鼠中对全脑进行了单细胞空间转录组学（scST）分析（性别平衡地共16个动物16个切片：图1A和S1；数据集质量：图S2；逐动物分析：图S3）。我们使用了一个包含347个基因的panel，其中包括247个来自10x Genomics小鼠脑panel的基因和100个额外选择的在发育中的皮层、SP和CLA中富集的基因（表S1）。

**图1 单细胞空间转录组学揭示发育中的大脑主要细胞类型**

(A) 单细胞空间转录组学实验和分析工作流程。
(B) 跨越各发育阶段的全脑切片单细胞空间转录组学图像，按聚类身份着色（每个发育阶段n = 4个生物学重复）。
(C) 完整数据集的UMAP嵌入，按聚类身份着色。
(D) 同（C），但按发育阶段着色。
(E) 点图展示关键标记基因在广泛细胞身份中的平均基因表达（颜色）和表达细胞百分比（点大小）。

我们通过合并和整合所有数据集生成了一个scST图谱，随后进行降维和相对粗略的聚类，以提供皮层发育的概述。该图谱，此后称为"完整"图谱，包含超过150万个细胞。完整图谱中的细胞类型根据空间位置、发育阶段和经典标记表达进行表型鉴定（图1B、1D和1E），其中大多数聚类能够通过这种方式与已知细胞类型关联（n = 12/17个聚类已定义）。

为了从该完整图谱中提取和分析皮层细胞，我们根据聚类来源基本局限于皮层进行子集化，获得448,261个细胞（图2A）。该皮层子集进行降维和高分辨率聚类，以解析发育中皮层细胞类型的更精细的异质性。所得聚类捕获了不同的皮层细胞群体（图2B；均匀流形近似和投影[UMAP]展开：图S4），随后被归类为粗略类别，以提供主要皮层细胞类型的概述（图2C）。UMAP可视化揭示了包含从瞬态到成熟状态的发育模式：E12.5–E15.5聚类定位于增殖区和瞬态区域，而E18.5–P1聚类转变为更具定义的非增殖群体（图2B–2E）。皮层身份通过经典标记进一步验证（图2E），包括放射状胶质细胞（RGCs）、中间祖细胞（IPCs）、兴奋性细胞、抑制性细胞、浅层细胞、深层细胞以及构成SP和CLA的神经元。数据集中未发现显著的性别特异性差异（图S5）。最终，该scST图谱以单细胞分辨率鉴定了从祖细胞到终末分化细胞类型的已知主要细胞群体，既涵盖整个脑切片，也包括皮层内。

**图2 发育中的皮层细胞类型**

(A) 跨越各发育阶段的皮层细胞类型聚类的单细胞空间转录组学谱，颜色代表聚类身份（每个发育阶段n = 4个生物学重复）。比例尺：500 μm。
(B) 皮层数据集的UMAP嵌入，按聚类身份着色。
(C) 同（B），但按广泛细胞类型着色。
(D) 同（B），但按年龄着色。
(E) 关键标记基因在广泛细胞身份中的平均基因表达（颜色）和表达细胞百分比（点大小）。

**底板和纹状体在发育上不同**

基于出生后发育过程中共享标记基因表达（包括Nr4a2），SP和CLA被认为共享发育起源和相似的发育进程。然而，在早期发育时间点对其标记基因表达的了解和比较尚缺乏，而我们在scST数据集中寻求对此进行直接比较。为此，我们根据空间位置鉴定SP和CLA聚类，两种细胞群体在E15.5时首次解剖学可识别（图3A和3B）。SP和CLA均表达了已知与CLA和皮质SP相关的标记，如Nxph4、Kcnab1、Ccn2、Cplx3和Tle4。有趣的是，这些基因在SP中表现出偏向性表达，而CLA则显著更高地表达了其他已知的CLA特异性标记，包括Nr2f2和Cux2（图3C）。因此，该分析展示了标记基因表达的分化，包括已知与SP和CLA群体两者相关的基因。

**图3 底板和纹状体在发育上不同**

(A) 底板和纹状体在各发育阶段的空间位置（每个发育阶段n = 4个生物学重复）。浅灰色点代表Neurod6转录本。比例尺：500 μm。
(B) 在皮层UMAP嵌入中高亮的底板和纹状体聚类。
(C) 底板和纹状体假批量标记基因的箱线图。箱线图显示中位数和四分位距（IQR），须延伸1.5倍IQR。
(D) 皮质深层标记（左）和浅层标记（右）的基因表达。
(E) 底板和纹状体差异基因表达的火山图（显著基因以红色标注，log2FC > 2且pADJ < 0.001）。
(F) 底板、纹状体和瞬态细胞类型的UMAP嵌入（左），以及代表性切片（P1）。比例尺：500 μm，插图：100 μm。*pADJ < 0.05，**pADJ < 0.01，***pADJ < 0.001，通过Kruskal-Wallis检验配Dunn事后检验和Benjamini-Hochberg校正（C）。

在皮层UMAP中，我们观察到细胞类型特异性地朝浅层和深层模式分化的趋势，示例基因提供了表达模式，为在更广泛的皮层成熟中解读SP和CLA细胞提供解剖学和分子学背景（图3D）。在此分化中，SP聚类定位于深层皮质成熟的终点，与其与深层兴奋性细胞的分子相似性一致。相比之下，CLA聚类定位于浅层皮质成熟的终点，表明其分子谱与浅层细胞类型更为一致。支持这一结论的是，我们发现深层标记Foxp2的表达在SP中显著高于浅层和CLA，而浅层标记Satb2在SP中显著低于浅层（图S6A和S6B）。相比之下，浅层标记Cux2在CLA中的表达显著高于深层和SP。经典的SP和CLA标记在各发育阶段特异性地表达于各自细胞类型中，而深层和浅层标记在各发育阶段内分别偏向表达于SP和CLA群体中（图S6C）。

为了明确分析CLA和SP聚类之间的差异，我们在假批量样本上计算了差异表达基因（DEGs）。总panel中有相当数量的基因在SP和CLA中差异表达（分别有19个和23个基因满足校正后p值（pADJ）≤ 0.001和绝对log倍数变化（FC）> 2；图3E）。在SP中，已知标记显著表达，如Nxph4、Kcnab1、Cplx3和Tle4。其他新发现的SP标记包括涉及神经元分化和发育的基因（Zfmp2、Pcsk5和Foxp2）、细胞外基质（ECM）和细胞黏附基因（Tmem132d、Col19a1和Fmod）以及突触功能基因（Syt6）。在CLA中，涉及ECM和细胞黏附的基因（Col16a1和Arhgap6）和突触功能基因（如Slc44a5、Cbln1、Unc13c和Syt17）显著表达，此外还有神经营养生长和导向因子（Bdnf和Nrp2）。

最终，我们的结果表明，SP和CLA具有独特的发育进程，这体现在它们独特的转录组特征和空间位置上。为了进一步验证SP和CLA代表分子上不同的群体，我们将暂时性群体（RGCs、IPCs和中间区[IZ]）与SP和CLA簇一起提取，并进行了降维和聚类分析。在粗分辨率下，该分析从转录组和空间上解析了皮质SP和CLA。CLA由主CLA（CLp）和CLA内SP（CLSp）组成，后者与皮质SP连续（图3F）。这表明从E15.5起，SP和CLA在转录组和空间上仍然保持独立；然而，在暂时性细胞类型内无法解析出独立的SP或CLA细胞类型。

单细胞RNA测序分析复现了SP和CLA的发育分化

为了验证我们在scST分析中识别到的SP和CLA的发育图案和转录组特征，我们分析了一个先前发表的涵盖胚胎期（E12.5、E15.5和E18.5）和早期出生后（P1）阶段的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（图4A）。该数据集由从E15.5、E18.5和P1显微解剖的体感皮质制备的单细胞悬液产生，E12.5则取体感皮质的中侧区域进行显微解剖，每个时间点一个生物学重复。从每个阶段选择线粒体基因表达较低的高质量细胞，使用互近主成分分析（RPCA；见STAR Methods）合并和整合各阶段数据，最终保留36,686个细胞用于分析。我们执行了降维和聚类算法，产生了52个初始簇，随后根据发育阶段和经典标志基因表达将其归并为广泛的皮质细胞类型类别（图4B–4D；与scST数据比较：图S7）。

图4 下板和岛叶细胞在发育过程中具有独特的转录组特征

(A) scRNA-seq分析流程。(B) scRNA-seq数据集的UMAP嵌入图，按广泛细胞类型着色。(C) 同(B)，但按阶段着色。(D) 按阶段绘制的SP和CLA细胞类型的柱状图。(E) 用于分类广泛细胞类型的标志基因的平均基因表达量（颜色）和表达百分比（大小）。(F) 浅层和深层标志基因的表达。(G) SP和CLA标志基因的原始基因表达量箱线图。箱线图显示中位数和四分位距，须线延伸至1.5倍IQR。(H) scST皮质数据集的UMAP嵌入图和代表性切片，显示细胞类型预测。灰色点代表Neurod6转录本。比例尺：500 μm。(I) SP和CLA细胞类型总差异表达基因的UpSet图。

该分析提供了一种补充方法，以识别发育过程中出现的皮质主要细胞类型（图4B–4E）。发育进程始于早期阶段的RGCs和IPCs（E12.5–E15.5）。RGCs由Nes、Hes5、Pax6和Sox2定义，而IPCs由Eomes定义。两个群体也都表达增殖性细胞周期标志物，如Mki67和Ccnd2。这些早期暂时性细胞群体产生了分化的深层和浅层兴奋性图案，跨越E15.5–P1的后期阶段，与我们的scST发现一致（参见图3D）。与我们的scST发现一致，在深层和浅层发育进程的终点，SP簇位于深层群体（以Bcl11b、Pcp4、Fezf2和Foxp2等标志物为特征）的末端，而CLA簇位于浅层群体（以Satb2、Pou3f2、Cux1和Cux2等标志物为特征）的末端（图4B和4F）。如预期，该scRNA-seq数据集与我们的scST数据集之间总体吻合度良好（数据集间FC：R值=0.52，p值=2.2e?16，图S7；注意，由于scRNA-seq数据集每个时间点仅含一个重复，因此需要Wilcoxon秩和检验进行scRNA-seq差异表达分析）。总之，这些结果证实了SP和CLA细胞类型在皮质发育过程中以浅层与深层的图案发生分化。

对这些细胞类型的进一步分析提示存在三种转录上不同的SP细胞类型和一种CLA细胞类型。SP包括：(1) SP-IPC细胞类型（E12.5–E15.5），标志物为Nxph4和IPC标志物Eomes；(2) 疑似SP细胞类型（E12.5–E18.5），表达Nxph4、Tle4和Zfpm2，且缺乏RGC/IPC标志基因表达；(3) 终末SP细胞类型（E15.5–P1），表达Nxph4、Kcnab1、Tle4、Zfpm2和Nr4a2。CLA细胞类型（E18.5–P1）由Nr4a2、Gnb4、Rgs6和Lxn表达定义，与我们的scST结果相似，没有证据表明存在疑似或中间型CLA亚型（图4B、4E和4G）。

为了进一步验证CLA是否被捕获在scRNA-seq数据集中，我们使用SingleR单细胞分辨率分析，以注释的scRNA-seq数据集为参考，对皮质scST数据集进行了分析（参见图2）。scRNA-seq在UMAP嵌入和空间上均在我们的皮质scST数据集中识别了CLA（图4H）。此外，SP和CLA内未观察到性别差异的证据（图S8）。检查SP和CLA细胞类型间的差异表达基因（DEGs），我们鉴定出60个SP-IPC独有的DEGs，111个疑似SP独有的DEGs，317个SP独有的DEGs，以及139个CLA独有的DEGs。共享标志物包括SP和CLA间的112个基因，疑似SP和SP-IPC间的32个基因，以及SP和疑似SP间的37个基因（图4I）。SP-IPC表达与早期发育过程相关的标志物（如Epha3、Nrp1、Ddr1、Acvr2b和Unc5d）和转录因子（如Eomes、Nhlh1和Ebf2），而疑似SP表达与神经元分化（如Nefl、Nefm和Draxin）和突触发育（如Ctnna2、Grik2和Gabra2）相关的标志物。SP表达与突触发育和成熟（如Sv2a、Snap91、Kcnab1和Scn2a1）及ECM/细胞表面修饰（如Fut9、Hs3st4、Timp2和Col19a1）相关的标志物。CLA还表达与突触传递（如Gria4、Cplx1和Grm5）以及神经元信号传导/细胞黏附（如Rgs6、Gnb4、Cdh12和Cdh8）相关的标志物（表S2）。总之，这验证了我们在scST分析中鉴定的终末分化SP和CLA群体，并提示先前在祖细胞群体中未被解析的SP亚型异质性。

疑似SP表现出独特的转录组特征，可能源自独特的RGC群体

有趣的是，我们在scST分析（图2B–2D）和scRNA分析（图4B–4D）中均未观察到SP簇中存在E12.5细胞。此外，尽管我们的scST结果将SP解析为单一群体，scRNA-seq分析却提示了疑似SP亚型的存在，这可能指示粗分辨率下未被捕获的额外转录组异质性。综合这些结果，促使我们使用scST数据集对祖细胞群体进行详细分析，以理解SP的成熟过程。

为此，我们从皮质数据集中提取暂时性细胞类型（RGCs、IPCs和IZ细胞），进行降维和聚类，然后根据标志基因表达、空间位置和发育阶段将其归并为广泛身份（图5A–5D）。在祖细胞子集中，我们鉴定出三个表达已知SP标志物的独特簇：皮质RGC群体（Nr4a2）、疑似SP/海马RGC亚型（Nxph4）和疑似胶质发生性RGC亚型（Ccn2）（图5A、5B和5D–5F）。胶质类RGC亚型表现出与SP相关群体不同的转录特征（包括胶质标志物Aqp4、Gfap和Olig1），因此未进一步考虑。

图5 疑似下板细胞源自独特的RGC群体

(A) 脑室区子集的UMAP嵌入图，按广泛细胞身份着色（每个发育阶段n=4个生物学重复）。(B) 同(A)，但按细胞类型簇着色。(C) 同(A)，但按发育阶段着色。(D) 各广泛细胞身份中关键标志基因的平均原始基因表达量（颜色）和表达细胞百分比（点大小）。(E) 表达已知下板标志物的暂时性亚型的空间位置。浅灰色点代表Neurod6转录本。比例尺：500 μm。(F) 拟批量标志基因的箱线图。箱线图显示中位数和四分位距，须线延伸至1.5倍IQR。(G) 同(A)，但按SingleR通过scRNA-seq参考数据集分配的细胞类型预测着色。(H) 同(E)，但按预测细胞类型着色，并展示E12.5和E15.5的代表性切片。浅灰色点代表Neurod6转录本（比例尺：500 μm）。?pADJ<0.05，??pADJ<0.01，???pADJ<0.001，通过Kruskal-Wallis检验配合Dunn事后检验和Benjamini-Hochberg校正（F）。

位于E12.5脑室区的皮质RGC群体，对SP标志物（Nr4a2）、RGC标志物（Hes5）、IPC标志物（Eomes）和增殖标志物（Mki67）的表达显著更高，与SP来源的RGC身份一致（图5A、5B、5F和5G）。疑似SP/HPC RGC亚型在E12.5位于最浅层，对SP标志物（Nxph4）、IPC标志物（Eomes）和非增殖标志物（Rbfox3）的表达显著更高（图5E和5F），在空间和转录组上与疑似SP一致。为了进一步验证Nxph4在疑似SP簇中的定位，我们确认Nxph4富集于疑似SP细胞中，并在相邻祖细胞群体中基本不存在（图S9）。值得注意的是，该簇的空间位置在E12.5和E15.5之间发生了偏移，从E12.5的皮质脑室区转变为E15.5的海马脑室区（图5E）。

这种空间偏移提示E12.5疑似SP可能与海马祖细胞群体存在发育关系。为验证该身份，我们使用SingleR单细胞分辨率分析，以注释的scRNA-seq数据集为参考（参见图4）。scRNA-seq数据集中识别的IPC-SP和疑似SP在scST数据中的空间上与疑似SP一致（图5E、5G和5H），证实E12.5疑似SP与海马RGC/IPC群体共享分子特征（图5G和5H）。综上，这些结果表明SP细胞可能源自独特的RGC亚型，且疑似SP与RGC/IPC群体具有分子相似性。

SP具有在发育过程中出现的独特亚型

鉴于scRNA-seq分析提示SP亚型的存在，我们接下来试图检查scST数据集中是否存在空间和转录组上不同的SP亚型。为此，我们提取SP簇并进行降维后的粗分辨率聚类，解析出四个SP簇（图6A–6C），此后定义为亚型I（不成熟）、II（不成熟）、III（过渡型）和IV（成熟型）。该分析还揭示了另外两个亚型（V和VI），其表达通常与抑制性神经元相关的基因（Gabra2、Calb2、Gad1和Gad2；图S10），因此未进一步分析。进一步验证该亚型身份，各SP亚型中抑制性和胶质相关标志基因污染极小（图S11）。

图6 发育过程中下板亚型的变化

(A) 下板图谱示意图。(B) 各发育阶段下板亚型的空间位置（每个发育阶段n=4个生物学重复）。浅灰色点代表Neurod6转录本（比例尺：500 μm，插图：100 μm）。(C) SP子集的UMAP嵌入图，按亚型着色。(D) 同(C)，但按发育阶段着色。(E) 按年龄绘制的亚型柱状图。(F) 拟批量SP标志基因的箱线图。箱线图显示中位数和四分位距，须线延伸至1.5倍IQR。(G) 同(F)，但按年龄着色。(H) UpSet图，显示亚型间交集差异表达基因和各亚型总差异表达基因。(I) E15.5与P1之间差异基因表达的火山图（显著基因以红色显示，满足log2FC>2和pADJ<0.001）。?pADJ<0.05，??pADJ<0.01，???pADJ<0.001，通过Kruskal-Wallis检验配合Dunn事后检验和Benjamini-Hochberg校正（F和G）。

亚型I和II含有最高比例的E15.5来源细胞，因此被分类为不成熟亚型。亚型III混合了所有阶段的细胞，因此被分类为过渡型亚型。最后，亚型IV含有最高比例的E18.5–P1来源细胞，因此被分类为成熟型亚型（图6D和6E）。这表明在不同发育阶段中存在独特的亚型。我们接下来通过经典SP标志物表达表征每个亚型。亚型IV（成熟型）对某些经典SP标志物的表达显著更高，包括Nxph4、Nr4a2、Kcnab1和Ccn2。与此一致，经典SP标志物在单细胞分辨率下的可视化显示这些SP标志基因在更广泛的SP和成熟SP细胞中富集，在相邻深层群体中表达极少（图S12）。

相比之下，亚型 I（未成熟型）的 Nr4a2 表达量显著较低，而亚型 II（未成熟型）的 Kcnab1 表达量显著较低，且 Nxph4 表达量虽无显著差异但也呈减少趋势（图 6F）。此外，与较早发育阶段相比，P1 细胞内 Nr4a2、Kcnab1、Cplx3 和 Ccn2 的表达量显著更高（图 6G）。为了进一步了解这些亚型之间的差异及其发育进程，我们进行了差异基因表达分析。每种亚型都可能与其独特的差异表达基因（DEG）集相关（分别为 35、24、4 和 14；图 6H 和表 S3）。由此，我们假设差异表达基因（DEG）也可直接源于发育年龄，并在 E15.5 和 P1 之间进行了类似的比对分析。在 E15.5，富集的基因包括参与转录调控和神经元身份的基因（Nhlh2、Zfp366、Prdm8 和 Lhx9）。相比之下，在 P1，参与突触功能的基因（例如 Cplx3、Syt6、Necab2 和 Nrgn）以及细胞外基质（ECM）/粘附/导向基因（Ccn2、Cd44 和 Sdk2）显著表达（图 6I）。综上所述，这些结果表明副层（SP）由在整个发育过程中动态变化的独特亚型组成，这与 SP 在特定时间点具有专门功能相符。

发育中的岛叶细胞具有独特的转录组特征，这与它们源自侧皮质流相一致

接下来，我们试图检查岛叶（CLA）在发育过程中的转录组异质性。为此，我们构建了侧皮质流（LCS）的一个子集，该区域与迁移细胞类型和岛叶相关（图 7A），并采用粗分辨率的降维和聚类方法识别不同的亚型（图 7B 和 7C）。值得注意的是，岛叶簇主要由后期发育阶段（即 E15.5、E18.5 和 P1）的细胞组成，并出人意料地重现了已知的岛叶不同亚域。具体而言，岛叶由 CLp（由紧邻岛叶皮层的致密细胞片组成）和位于 CLp 内侧并与皮质副层（SP）连续的 CLSp 组成，这两个区域均在我们的人单细胞空间转录组（scST）聚类中被识别出来（图 7B 和 7C）。

图 7 源自侧皮质流的岛叶亚型
显示完整图注 图查看器
(A) CLA 复合体和 LCS 图谱示意图。
(B) 不同发育阶段岛叶亚型的空间位置（每个发育阶段 n = 4 个生物学重复）。
(C) CLA 复合体和 LCS 子集的 UMAP 嵌入图，按亚型着色。
(D) 同 (C)，但按发育阶段着色。
(E) 按年龄绘制的亚型比例。浅灰色点代表 Neurod6 转录本（比例尺：500 μm，插图：100 μm）。
(F) CLA 和 CLA-下板层特异性标志基因表达的伪批量表达箱线图。箱线图显示中位数和四分位距，须线延伸至 1.5 倍 IQR。
(G) 描绘亚型之间交集差异基因及每个亚型总差异基因的 Upset 图。
(H) E15.5 和 P1 之间差异基因表达火山图（红色为显著基因，符合 log2FC > 2 和 pADJ < 0.001）。?pADJ < 0.05，??pADJ < 0.01，???pADJ < 0.001 通过 Kruskal-Wallis 检验及 Dunn 事后检验和 Benjamini-Hochberg 校正（F）。

在 E12.5，未检测到明确的岛叶细胞。然而，我们识别出两个 LCS 亚型：LCS 亚型 I 和 LCS 亚型 II/储层（图 7B 和 7C）。LCS 亚型 I 在空间上与脑室区连续，并过渡到亚型 II，形成 LCS 储层。有趣的是，LCS 亚型 I 和 II 有表达经典岛叶标志物（Nr2f2）的细胞（图 7F）。这表明在 E12.5，岛叶细胞仍在迁移到其终末位置，这与推测的副层（SP）形成对比，后者在此阶段已达到终末位置（参见图 5A、5B 和 5E）。为了进一步评估 E12.5 LCS 内的 Nr2f2 阳性细胞是否代表异质迁移流中的迁移岛叶细胞，我们检查了 Nr2f2 与抑制性和前体标志基因的单细胞定位（图 S13）。我们发现抑制性转录本主要定位于 LCS 外的细胞，LCS 内部由前体标志基因造成的污染极小。此外，E12.5 LCS 既包含 Nr2f2 阳性细胞，与推测的迁移岛叶细胞一致，也包含 Nr2f2 阴性细胞，可能反映该异质迁移流中的其他细胞类型。到 E15.5，岛叶内观察到 Nr2f2 表达，且在 LCS 中减少，支持 E12.5 LCS 中的 Nr2f2 阳性细胞代表迁移的岛叶细胞，随后到达发育中的岛叶。

岛叶结构最早在 E15.5 出现，并由 Nr4a2 和 Nr2f2 的表达定义。在粗分辨率下，我们识别出三种岛叶亚型，每种都有独特的空间位置和基因表达谱，此后称为岛叶亚型 I、岛叶亚型 II 和 CLSp（图 7B 和 7F）。岛叶亚型 I 位于岛叶亚型 II 的背侧，并在 E18.5 和 P1 包括岛叶皮层内的细胞。两种亚型都显著高水平表达岛叶经典标志物 Nr4a2。亚型之间浅层标志物（Cux1 和 Cux2）的表达没有显著差异。我们也识别了 CLSp，虽然它与皮质 SP 连续，但在更广泛的皮质数据集中与岛叶聚类（图 2A–2C）。CLSp 显著更高表达经典 SP 标志物（Nxph4、Kcnab1 和 Ccn2）。总体而言，这些发现表明岛叶细胞可能早在 E12.5 就开始在 LCS 内迁移，然后在 E15.5 左右作为一个独立结构出现，并继续发育。

为了理解这些亚型之间的差异，我们进行了差异基因表达分析（图 7G 和表 S4）。差异表达基因在 LCS 亚型 I 和 II、岛叶亚型 I 和 II 以及 CLSp 中富集（分别为 62、19、29、25 和 63 个基因）。此外，我们识别了 LCS 亚型 I 和 II、岛叶亚型 I 和 II 以及 LCS 亚型 I 和岛叶亚型 I 之间的共享差异表达基因（分别为 45、8 和 6）。最后，正如我们的 SP 分析一样，我们识别了 E15.5 和 P1 之间差异表达的基因。在 E15.5，富集基因包括参与生长和前体身份的基因（Igf2 和 Eomes），而在 P1，参与突触功能和可塑性的基因（例如 Pcp4、Scg2、Cpne6、Fos 和 Drd1）显著表达（图 7H）。总之，这些发现强调 LCS 和岛叶亚型由不同的转录组特征定义，具有阶段特异性差异，与发育成熟一致。

讨论
尽管共享某些特征，SP 和岛叶具有不同的发育模式

SP 和岛叶之间共享多种空间、成熟和行为特征。空间上，SP 和岛叶占据深皮层的相邻区域，SP 形成最深的皮质层，而岛叶位于岛叶皮层下方腹外侧。发育上，这两个群体都是最早出生的大脑皮层神经元（E10.5–E12.5）之一，并与相似的标志基因相关。具体而言，在胚胎发育期间，SP 和岛叶共享深层标志物（Satb2）和浅层神经元命运标志物的表达（Cux2、Pou3f3、Pou3f2 和 Lmo4）。在成熟期，成体中 SP 来源的 L6b 和岛叶都表现出 Nr4a2 的表达，且其他 SP 特异性标志物（Cplx3、Tle4 和 Ctgf）形成从 L6b 到岛叶最深层的连续表达带。此外，这两个结构都对相似的功能和行为特性做出贡献，包括整合多样输入和调节睡眠 - 觉醒周期。这一整体工作突出了 SP 和岛叶之间的相似性，并暗示共享起源和发育进程。

与此相反，在我们的 scST 和 scRNA-seq 分析中，我们确定 SP 和岛叶在出生后发育期间发生分歧。特别是，成熟的 SP 和岛叶分别类似于皮质深层的分子谱（包括 Bcl11b、Pccp4、Foxp2 和 Fezf2 的表达）和皮质浅层的分子谱（包括 Satb2、Pou3f2、Cux1 和 Cux2 的表达）（图 3D 和 4F）。值得注意的是，我们确定岛叶内 Nr2f2 的表达显著更高，表明 Nr2f2 可能代表岛叶身份的选择性标志物（图 3C）。我们也识别了一系列在 SP（例如 Zfpm2、Col19a1 和 Foxp2）和岛叶（例如 Slc44a4、Cbln1 和 Angpt1）之间显著不同的标志物（图 3E）。这表明虽然 SP 和岛叶确实共享某些标志物的表达，但它们具有独特的分子特征，导致皮质发育的分歧。有趣的是，最近的大马猴岛叶图谱报道岛叶谷氨酸能神经元类似于深层岛叶神经元，而我们研究中的小鼠岛叶显示出与浅层细胞更大的相似性。尽管物种特异性分子差异可能导致这种差异，另一种解释是类似上层的神经元在小鼠和大马猴岛叶中都保守，但在小鼠岛叶群体中占更大比例。

我们结果的几个方面与这些差异由不同的发育进程驱动相一致。首先，在这些区域的出生窗口期间，我们确定推测的 SP 类似于增殖性 IPC 细胞类型的分子谱，这可能反映了一个向 SP 样命运分化的过渡群体（图 5A、5E 和 5F）。值得注意的是，我们没有在这个时间点识别出推测的岛叶（图 5A）。第二，在 E12.5 我们识别了一个与 SP 来源一致的独特 RGC 群体（图 5A、5E 和 5F）；相反，在 LCS 中识别出表达 Nr2f2 的岛叶相关细胞，表明这些细胞在此时间窗口内仍在迁移到其终末位置（图 7A、7E 和 7F）。第三，SP 和岛叶亚型的转录组特征在不同的时间尺度上演变：SP 在整个发育过程中表现出异质性（图 6A–6C、6E 和 6F），而岛叶在整个发育过程中保持稳定的亚型，具有独特的分子特性（图 7A–7C、7E 和 7F）。

这些关于 SP 和岛叶独特发育进程和成熟身份的发现与观察到这些细胞在发育期间的独特时空动态相一致。值得注意的是，岛叶遵循径向/逆向迁移模式，并在 E14.5–15.5 左右形成独立结构，而 SP 径向迁移并可在更早时间点观察到，表明这些区域可能具有分歧的发育模式。

SP 和岛叶中发育异质性的含义

尽管之前已描述了 SP 特异性基因表达的暂时性变化，但发育期间转录组和空间异质性的程度仍未解决。在此，我们旨在了解 SP 的转录组和空间异质性，并解析了四种具有不同分子特征并在整个发育过程中存在的 SP 亚型。SP 亚型 I（未成熟型；E15.5–E18.5 富集）表达富集于 ECM 组织和轴突导向的基因（Reln、Sema3e、Rspo2 和 Col19a1），以及前体特异性标志物（Hes5、Sox11 和 Meis2）的耗竭，表明早期分化的 SP 群体建立细胞外支架和新生突触连接。SP 亚型 II（未成熟型；E15.5–E18.5 富集）表现出与突触发生相关的基因（Gsg1l 和 Syt6）、深层身份（Foxp2）的上调，以及发育早期标志物（Reln、Rspo2 和 Sema3e）的下调，反映未成熟状态。亚型 III（过渡型；E15.5–P1 富集）表达参与早期发育信号的基因（例如 Arhgap6 和 Dkk3）。亚型 IV（成熟型；P1 富集）表达参与导向细化和神经调节信号的基因（Tacr1 和 Nrp2），同时下调导向和层状命运决定基因（Cdh6、Nell1、Rorb 和 Pou3f1）（图 6I 和表 S3）。最终，这些发现突出了驱动 SP 异质性的时间和转录组因素，并暗示在狭窄的发育窗口期内具有独特的功能角色。

先前的解剖学和发育学研究表明，岛叶由空间上独特的细胞群体组成，在发育期间具有专门的分子特征。最近，在成体岛叶中识别出两种岛叶亚型，岛叶细胞也存在于背侧端内嗅叶核（EpD），该区域位于 CLp 腹侧，通常通过稀疏表达岛叶特异性标志物而与岛叶区分开来。此外，互补工作识别了称为 Arimatsu 细胞的岛叶相关分散细胞，它们 reside 于岛叶皮层内并表达 Nr4a2 和 latexin，可能通过逆向迁移建立，并代表成体岛叶中描述的壳投影神经元的早期对应物。在我们的研究中，我们寻求采取数据驱动的方法来理解组成岛叶的神经元的转录组异质性和空间模式。

通过上述分析，我们鉴定了两种不同的CLA亚型：CLA亚型I表达与细胞黏附/轴突导向相关的标志物（Cdh6、Rspo2、Rtn4r和Tacr1），并且前体/增殖基因标志物（Pax6、Mki67和Ccnd2）表达较低，提示其为迁移性群体（图7H和表S4）。该亚型还占据背侧区域，包括延伸至岛叶皮层的一个弥散群体，与先前描述的Arimatsu细胞相对应（图7E）。CLA亚型II表现出突触调节因子（Cbln1、Unc13c、Cpne6、Nrgn、Rasgrf2和Scg2）和神经营养因子（Bdnf、Htr1f和Rbp4）的上调，这可能反映神经元形成成熟的突触连接（图7H和表S4）。该亚型占据腹侧区域，涵盖与EpD（内层板）对应的区域（图7E）。值得注意的是，亚型I和II均表达CLA特异性标志物，提示CLp和EpD构成分子连续的CLA。综合而言，这些发现凸显了发育期间SP和CLA所遵循的根本不同的组织特性：SP表现出具有独特转录组特征的多个亚型，但空间组织相对缺乏；而CLA则表现出明显的空间结构域。

**超越SP和纹状体的发展中细胞类型研究**

近期在小鼠和人类中开展的转录组学研究已开始构建大脑发育细胞图谱，捕捉胚胎期和出生后早期阶段的分子转变和空间组织。这些大规模数据集为理解神经元和非神经元的发育进程和空间模式提供了宝贵的资源。一项研究在单一时间点使用组合索引小核RNA测序（snRNA-seq）对101个胚胎中的约160万个细胞核进行了表征，提供了广泛的覆盖，但每个胚胎的深度有限且缺乏空间信息。另一项工作生成了跨越产前、产后和成年阶段的约120万个单细胞转录组，但缺乏空间分辨率。我们的工作从大脑中获取了约150万个空间分辨细胞，涵盖四个关键发育时间点的超过300个标志基因，补充并扩展了这一工作。该数据集为每个动物提供了更多的细胞数量，并能够实现转录组身份到精确解剖位置的直接映射。此外，它提供了在单细胞分辨率下理解从祖细胞到终末分化细胞类型的发展中细胞类型的时空进展的伟大机会。我们进一步开发了一个交互式门户网站（https://developingbrainatlas-cellestialcortex.com/），允许用户探索发育不同时间点的大脑皮层细胞类型和基因表达。综合而言，这些特点使我们的数据集成为迄今为止定义大脑中发展中细胞类型起源、成熟和空间组织的最全面资源之一。

**研究局限性**

本研究存在若干局限性，需要注意。首先，我们的scST数据集使用了347个基因的系列，其中有多种基因靶向SP和CLA神经元。这种方法提供了保留空间上下文的高灵敏度单细胞分辨率，但由于该基因系列未提供全转录组广度，可能对特定细胞类型引入潜在偏差。其次，我们的性别特异性分析受样本量限制，每个发育阶段包含2只雄性和2只雌性动物。虽然我们未检测到显著的性别特异性差异，但未来研究中加入更多动物将有助于充分阐明和验证发育期间潜在的性别依赖转录组差异。第三，我们的细胞类型成熟度比较通常年龄匹配，但发育中的异时性可能是群体间观察到的额外差异表达的原因。第四，尽管我们的研究基于标志基因表达提出了亚型的潜在功能，但仍需进一步研究以阐明功能活性及其与SP和CLA亚型转录组和空间特性的关系。为引导这一未来工作，我们通过本研究产生的scST数据提供了SP和CLA中一系列可靶向的分子，可用于指导进一步将分子和细胞特性与高级回路及功能特性联系起来的研究。

**资源可用性**

**主要联系人**

更多信息及资源和/或试剂的请求应发送至主要联系人，Mark S. Cembrowski（[e-mail]），并由其提供。

**材料可用性**

本研究未产生新试剂。

**数据和代码可用性**

- 单细胞RNA测序数据可从Bella等人处获取（GEO: GSE153164）。
- 单细胞空间转录组学数据已存于GEO并可用（GEO: GSE310599）。
- 所有原始代码已存于并可供使用。
- 重新分析本论文报告数据所需的任何附加信息可向主要联系人索取。

**致谢**

M.S.C. 由加拿大自然科学和工程研究委员会（RGPIN-2024-03916）、加拿大创新基金会（John R. Evans Leaders Fund 38369）和加拿大苏格兰会慈善基金会（研究基金编号22101）资助。S.I. 由加拿大自然科学和工程研究委员会的加拿大研究生奖学金——博士项目资助。本研究部分得到了不列颠哥伦比亚大学高级计算研究中心提供的计算资源和服务中心的支持，以及Djavad Mowafaghian脑健康中心神经影像与神经计算核心的Jeff LeDue团队的支持（RRID: SCR_019086）。我们感谢Dr. Jessica Rosin在胚胎组织分离方面的见解和指导。我们还感谢不列颠哥伦比亚大学诊断和研究组织学实验室的Ingrid Barta在单细胞空间转录组学的组织制备和切片方面的支持。我们感谢Cembrowski实验室成员在有益讨论中的帮助，特别是感谢Dr. Larissa Kraus在实验方案和数据分析方面的指导。

**作者贡献**

S.I. 收集和制备了单细胞空间转录组实验的组织。S.I. 还进行了所有数据分析，包括单细胞RNA测序和单细胞空间转录组学，并撰写了论文。M.S.C. 监督了项目并撰写了论文。

**利益声明**

作者声明无利益冲突。

**生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的声明**

在准备本工作期间，作者使用ChatGPT审查语法和拼写。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑。未使用生成式AI工具产生任何新内容。作者对出版内容承担全部责任。

**STAR★方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 已存数据：snRNA-seq数据 | Bella等人 | GEO: GSE153164 |
| 已存数据：单细胞空间转录组学数据 | 本论文 | GEO: GSE310599 |
| 实验模型：生物体/品系 | 定时妊娠C57BL/6小鼠 | Jackson实验室 RRID:IMSR_JAX:000664 |
| 软件和算法 | RR Development Core Team | RRID: SCR_001905 |
| Seurat | Sajita等人 | RRID: SCR_016341 |
| 代码 | 本论文 | https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33233709 |

**实验模型和研究参与者详情**

**动物**

实验使用定时妊娠野生型C57BL/6小鼠，动物饲养于12小时反向光暗循环，自由获取食物和水。所有实验方案均获得不列颠哥伦比亚大学动物护理和使用委员会批准（动物方案编号：A22-0255）。将雄性和雌性C57BL/6小鼠配对繁殖，每天检查雌性小鼠是否存在阴道栓。当观察到栓时，标记为胚胎日0.5天（E0.5），雌性小鼠单独饲养直至妊娠结束。

**方法细节**

**单细胞空间转录组学的组织收集和制备**

胚胎在胚胎日12.5天（E12.5）、E15.5和E18.5采集，出生后样本在出生后第1天（P1，出生标记为P0）采集。在所有情况下，将妊娠雌性深度麻醉，然后进行腹部切口取出子宫角，置于冰冷的1× PBS中。胚胎分离、断头并解剖脑，使用Leica M165 FC立体显微镜。幼鼠脑以类似方式解剖。收集尾巴进行性别基因分型，由不列颠哥伦比亚大学生物医学研究核心设施完成。解剖后，样本在4°C振荡条件下用10%中性缓冲福尔马林固定24小时，随后用1× PBS冲洗三次（每次5分钟），并在室温下用70%、50%和30%乙醇脱水1小时。样本在4°C的70%乙醇中保存直至石蜡包埋和切片，由不列颠哥伦比亚大学诊断和研究组织学实验室完成。

**单细胞空间转录组学数据获取**

样本由不列颠哥伦比亚大学诊断和研究组织学实验室按照Xenium In Situ FFPE Tissues – Tissue Preparation Guide（10× Genomics）制备。共使用16只动物，每个发育阶段2只雄性和2只雌性。组织在12 × 24 mm捕获框的Xenium载玻片上切成10 μm厚度。随后，载玻片在室温下用干燥剂保存，并在五天内使用。使用时，载玻片脱蜡、组装到Xenium卡盒中并根据Xenium In Situ FFPE Tissues – Deparaffinization and Decrosslinking protocol（10× Genomics）进行解交联。接下来，按照Xenium In Situ Gene Expression with Cell Segmentation User Guide（10× Genomics）进行操作。探针杂交在50°C进行16–24小时，使用预设计的247探针Xenium小鼠脑基因表达系列（10× Genomics，货号：1000462）结合定制的100探针附加系列（10× Genomics，货号：XER9KU；数据表S1），靶向皮层发育和皮层下板标志基因。接下来，载玻片洗涤以去除未杂交的探针，随后在37°C进行2小时的连接程序以将探针退火至mRNA靶标。随后，探针通过滚动圈扩增PCR在37°C进行2小时的酶促扩增。扩增孵育后，组织在4°C封闭和染色16–24小时。接下来，施加染色增强剂，随后加入自发荧光淬灭剂和DAPI核染色。载玻片卡盒最终装载到Xenium分析仪上进行荧光探针 hybridization、成像和解码。Xenium分析仪在转录本定位中提供高空间精度，XY定位低于30 nm，Z定位低于150 nm，图像分辨率约为0.2 μm/像素。

**单细胞空间转录组学数据分析**

数据使用R（v4.4.2）中的Seurat包（v5）和类似的内部代码进行分析，类似于先前发布的工作流程。以下代码使用默认参数，除非另有说明。合并十六个组织切片，并去除计数为零的细胞（nCount_Xenium = 0）。合并的数据集使用SCTransform()进行归一化，通过RunPCA()进行降维，使用IntegrateLayers(method = HarmonyIntegration, orig.reduction = "pca", new.reduction = "harmony", normalization.method = "SCT")进行整合，通过RunUMAP(dims = 1:40)嵌入二维UMAP，并使用共享最近邻图进行聚类，通过FindNeighbors(dims = 1:40)和FindClusters(resolution = 0.1)。

为从E12.5全胚胎样本中分离出全脑，使用Crop()根据每个E12.5样本对应的x和y坐标裁剪区域。该涵盖所有四个发育阶段的完整数据集随后被重新处理。具体而言，数据集使用SplitObject(split.by = "animal")分割。每个样本使用SCTransform()归一化，随后在每个样本内使用SelectIntegrationFeatures()检测可变特征。数据集随后使用ScaleData()处理，通过RunPCA(features = 选定的可变特征)降维，使用IntegrateLayers()、RunUMAP(dims = 1:30)和聚类FindNeighbors(dims = 1:30)及FindClusters(resolution = 0.2)。

相同的可变特征选择、整合、降维和聚类工作流程应用于皮层（dims = 1:15；resolution = 0.8）、瞬时（dims = 1:20；resolution = 1.0）、皮层下板（dims = 1:10；resolution = 0.2）和纹状体（dims = 1:20；resolution = 0.4）子集。对于这些分析，仅调整UMAP维度数和聚类分辨率，如所示。

对于差异基因表达分析，使用AggregrateExpression()生成拟批量表达谱。RNA计数在每个样本（按orig.ident）内的细胞间聚合。样本按细胞亚型和阶段、按阶段或按性别分组。对于拟批量比较，使用FindMarkers(test.use = DESeq2)评估差异表达。阶段特异性差异在E15.5和P1之间测试，性别差异在雄性和雌性样本之间测试数据集。显著基因定义为调整pADJ ≤ 0.001且绝对log FC > 2。并行地，使用FindAllMarkers(test.use = DESeq2, only.pos = FALSE, log FC threshold = 0.5)测试选定数据集内所有亚型间的广泛差异表达。显著基因在满足pADJ < 0.05且绝对log FC > 1时保留。

基因表达通过使用FeaturePlot()、DotPlot()、ImageFeaturePlot()绘制归一化计数进行可视化。对于点图，点的大小对应于该基因在该群体中具有非零表达的细胞百分比，而点的颜色代表平均表达水平。平均表达对应于平均z分数表达（相对于所有细胞中该基因的均值），正值表示高于正常平均表达，负值表示低于平均表达。

在箱线图可视化中，绘制的是伪聚合（pseudobulked）数据，其中箱体代表四分位距（interquartile range, IQR），中心线表示中位数，须线延伸至四分位距的1.5倍范围。为了对整合后的scST数据集中的细胞类型进行无偏的细胞类型注释以验证细胞类型，我们使用了SingleR（v2.8），这是一款计算工具，它利用参考转录组数据集（scRNAseq）独立预测每个细胞的来源类型。CellestialCortex（https://developingbrainatlas-cellestialcortex.com/）网页门户是使用R中的RShiny环境基于内部脚本开发的。该Shiny应用程序使用了Seurat包中的函数：DimPlot()、FeaturePlot()、ImageDimPlot()和ImageFeaturePlot()。

单细胞测序数据分析

单细胞测序分析基于公开可用数据集，针对四个发育阶段的小鼠胚胎皮质数据（E12.5、E15.5、E18.5和P1）进行。计算分析在R中使用Seurat v4完成。使用Read10X_h5(use.names = TRUE, unique.features = TRUE)加载所有发育阶段的数据，并使用CreateSeuratObject(min.cells = 3, min.features = 2000)创建Seurat对象。对于质量控制，筛选了percent.mt，并为每个发育数据集确定了最低截断值。对每个数据集，使用NormalizeData()对原始计数进行标准化，使用FindVariableFeatures(selection.method = "vst", nfeatures = 2000)鉴定可变基因。使用SelectIntegrationFeatures()选择共享的整合特征。使用ScaleData()对每个数据集进行缩放，并使用RunPCA()通过PCA降维。使用FindIntegrationAnchors(reduction.method = "rpca")确定整合锚点。使用IntegrateData()将数据集合并为单个整合对象，对整合数据集使用ScaleData()进行缩放，并使用RunPCA()进行降维。使用RunUMAP(dims = 1:30)生成UMAP嵌入，使用FindNeighbors(dims = 1:30)生成最近邻图，并使用FindClusters(resolution = 1.0)进行聚类。为评估数据集中潜在的性别相关差异，将表达Xist的基因大于0的细胞归类为Xist+，否则归类为Xist-。

使用FindAllMarkers(only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)鉴定簇特异性标志基因。默认情况下，该函数使用Wilcoxon秩和检验将感兴趣的簇中每个基因的表达水平与所有其他细胞进行比较。所得p值使用Bonferroni校正（pADJ）进行多重检验校正。此外，我们筛选了上调基因，最小绝对logFC为0.25，pct.1为0.25，pct.2为0.3。随后，我们对簇内表达进行排序，显著标志基因定义为校正p值<0.05且平均绝对log2倍数变化>1的基因，从总共18,274个基因中保留了5,126个独特基因。使用FeaturePlots()绘制原始RNA计数或通过箱线图可视化基因表达。使用UpSet图可视化差异表达基因（DEGs）的数量和关系。

定量与统计分析

除非另有说明，否则应用以下统计标准。箱须图显示特定细胞类型中基因表达的分布，其中中线代表中位数，箱体代表第一和第三四分位数，须线延伸至四分位距的1.5倍范围，超出此范围的任何点均视为离群值且不予可视化。对于scRNA-seq数据的差异基因表达分析，我们使用Wilcoxon秩和检验比较感兴趣的簇与所有其他细胞之间的基因表达。所得p值使用Bonferroni校正进行多重检验校正。对于单细胞空间转录组数据的伪聚合DEG分析，我们应用DESeq2，并使用Bonferroni校正获得pADJ。对于跨细胞类型或亚型的选定基因表达水平的统计比较，我们执行Kruskal-Wallis秩和检验，随后进行Dunn事后检验并使用Benjamini-Hochberg校正。校正pADJ值的统计显著性规定如下：ns: pADJ > 0.05；?: pADJ < 0.05，??: pADJ < 0.01，???: pADJ < 0.001。

补充信息（5）

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PDF（36.90 MB）Document S1. Figures S1–S13

文件（2.57 KB）Table S1. 单细胞空间转录组标准探针和自定义探针列表，与图1相关

文件（118.91 KB）Table S2. scRNA-seq中鉴定的subplate和claustrum亚型的差异表达基因，与图4相关

文件（14.73 KB）Table S3. subplate亚型的差异表达基因，与图6相关

文件（28.92 KB）Table S4. claustrum亚型的差异表达基因，与图7相关