优质与普通包包曲贮藏过程中微生物群落演替规律与差异特征

《Fermentation》：Microbial Succession Patterns and Differences During Storage of Baobaoqu of Different Qualities

　　

包包曲的质量直接决定了白酒的风味品质与产量。本研究采用宏基因组学（metagenomics）方法结合机器学习技术，包括多层感知器（multilayer perceptron, MLP）神经网络模型和SHapley Additive exPlanations（SHAP）方法，研究了两种等级包包曲在贮藏期间微生物群落及潜在酶系统的演替规律与差异特征。结果表明，优质包包曲比普通包包曲拥有更多样的微生物群落：优质包包曲共注释到1764个属和6901个种，而普通包包曲为1656个属和6440个种。排名前五的优势微生物属，即Weissella、Staphylococcus、Thermoactinomyces、Limosilactobacillus和Pediococcus，共同占据微生物总丰度的46.3–87.1%。研究人员鉴定出10个关键差异候选微生物标志物——包括Weissella confusa、Kluyveromyces marxianus和Staphylococcus lloydii——其中8个在优质包包曲中丰度显著更高。糖苷水解酶（glycoside hydrolases, GHs）构成最大的酶类，占总量的40.99%。显著区分二者的前十位潜在酶家族为GH43、GH31、GT9、GH2、CBM50、GH5、GH4、GT4和GT26，其中GH43、GH31、GH5和CBM50在优质包包曲中丰度更高。本研究系统揭示了不同质量包包曲在整个贮藏期间的独特微生物与酶学图谱，为优化包包曲工业化生产流程与贮藏策略提供了理论指导。

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1. 研究背景与科学问题

包包曲是中国浓香型白酒酿造中典型的中高温大曲，其质量水平直接决定白酒的感官特性和理化指标。在工业生产中，包包曲通常依据外观、断面结构和传统感官评价划分质量等级，缺乏微观层面的分子生物学基础。制曲完成后，包包曲必须经过贮藏陈化，这一阶段伴随酶活性的动态变化（如糖化力、液化力、发酵力和酯化力通常在贮藏三个月以上达到峰值）、微生物群落结构的显著重组以及功能基因表达模式的改变。然而，现有研究多聚焦于单一质量等级的样品，缺乏对不同等级包包曲贮藏过程中微生物演替差异的系统性比较分析。因此，深入探究不同质量包包曲贮藏期微生物群落的动态变化及其对品质分化的贡献，对于建立客观量化的质量评价体系、优化生产工艺和贮藏条件具有重要意义。

2. 研究设计与主要结论

本研究采用宏基因组学技术，结合多层感知器（MLP）神经网络模型与SHapley Additive exPlanations（SHAP）方法，对四川省宜宾市五粮液股份有限公司包包曲制作车间贮藏仓库中采集的优质（P）与普通（N）两类包包曲样品进行了系统分析。样品分别于贮藏第1、15、30、60和90天采集，每个时间点设三个生物学重复（每个贮曲房一份混合样），共计30份代表性样品。研究旨在揭示不同等级包包曲在贮藏过程中微生物群落、代谢途径和酶系统的差异，并构建基于微生物特征的品质预测模型。

主要结论包括：（1）优质包包曲的微生物丰富度高于普通包包曲，共注释到1764个属和6901个种；（2）优势微生物属为Weissella、Staphylococcus、Thermoactinomyces、Limosilactobacillus和Pediococcus，合计占微生物总丰度的46.3–87.1%；（3）通过机器学习鉴定出10个关键差异微生物标志物，其中8个在优质包包曲中丰度更高；（4）糖苷水解酶（GHs）是最大酶类（40.99%），GH43、GH31、GH5和CBM50在优质包包曲中丰度更高；（5）优质包包曲在贮藏后期富集了更多与氨基酸、有机酸和碳水化合物代谢相关的通路。这些发现为包包曲品质的客观量化评价和工艺优化提供了理论基础。

3. 关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术方法：

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  宏基因组测序与生物信息学分析：使用MGISEQ-2000平台进行高通量测序，经SOAPnuke质控、Bowtie2去除宿主序列、MEGAHIT组装后，利用MetaGeneMark预测基因，CD-HIT去冗余，Salmon定量基因丰度；物种注释采用Kraken2比对NCBI NT数据库，功能注释采用DIAMOND比对KEGG数据库、HMMER比对CAZy数据库。
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  多样性与差异分析：通过Chao1、Shannon和Simpson指数评估α多样性；采用主成分分析（PCA）、主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）比较β多样性；应用线性判别分析效应大小（LEfSe）筛选候选微生物标志物（LDA阈值>3）。
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  机器学习建模与可解释性分析：基于PyTorch构建多层感知器（MLP）神经网络模型（结构30→32→16→1），使用二元交叉熵损失和Adam优化器训练，结合SHAP方法进行特征重要性排序，评估了MLP、逻辑回归、LASSO、线性SVM、随机森林等多种模型的性能。

4. 研究结果详解

4.1 不同质量包包曲贮藏过程中微生物群落α多样性变化与差异分析

宏基因组分析获得349.54 Gbp原始数据，经处理后得到301.16 Gbp清洁数据，组装获得3,097,472条非冗余重叠群（contigs），N50长度为1929.9 bp，最终鉴定出641,046个单基因。α多样性分析显示，贮藏时间显著影响微生物群落丰富度（Chao1指数）。优质包包曲的微生物丰富度随贮藏持续增加，在第90天达到最高；普通包包曲则呈现先降后升的趋势。Shannon和Simpson指数表明，两类包包曲的微生物多样性在贮藏后期逐渐趋于稳定。

4.2 不同质量包包曲贮藏过程中微生物群落演替模式与差异分析

共注释到261个目（557科、1843属、7327种），优质包包曲注释到的分类单元数量（256目、544科、1764属、6901种）均高于普通包包曲（237目、510科、1656属、6440种）。共有优势属包括Weissella、Staphylococcus、Thermoactinomyces、Limosilactobacillus等13个属。在优质包包曲贮藏过程中，Staphylococcus相对丰度从64.67%急剧下降至6.42%（降幅90.07%），而Weissella从8.56%增至23.54%（增幅1.75倍），Thermoactinomyces从0.48%升至3.05%（增幅5.35倍）。物种水平上，优势种包括Leuconostoc citreum、Weissella confusa、Pediococcus pentosaceus等21个种，其中Staphylococcus gallinarum在优质包包曲中从39.79%降至3.77%（降幅90.53%），Leuconostoc citreum从2.51%增至18.91%（增幅6.53倍）。

PCA、PCoA和NMDS分析显示，不同等级和贮藏时间的包包曲微生物群落明显分离。置换多元方差分析（PERMANOVA）表明等级、贮藏时间及二者交互作用均显著影响微生物群落结构（p=0.001）。LEfSe分析鉴定出各贮藏时间点的候选微生物标志物，如优质包包曲贮藏1天的标志物包括Staphylococcus aureus、Staphylococcus gallinarum等；贮藏90天的标志物包括Leuconostoc citreum、Levilactobacillus brevis等。

机器学习分析显示，各模型准确率为0.80–0.93，ROC-AUC为0.86–0.96。MLP（64,32,16）准确率0.867（95% CI 0.733–0.967），AUC 0.956；物种数据中线性SVM表现最佳（准确率0.933）。SHAP分析揭示有效区分优质与普通包包曲的前10个关键微生物为：Weissella confusa、Kluyveromyces marxianus、Companilactobacillus paralimentarius、Pichia kudriavzevii、Staphylococcus gallinarum、Staphylococcus kloosii、Weissella confusa、Leuconostoc lactis、Leuconostoc citreum和Staphylococcus shinii，其中仅Pediococcus pentosaceus和Saccharopolyspora rosea在普通包包曲中丰度更高。

4.3 不同质量包包曲贮藏过程中微生物代谢分析

KEGG注释结果显示，一级代谢通路中代谢相关通路占比最高（71.98%），其次为遗传信息处理（10.22%）。二级代谢通路中，全局与概览图（40.16%）、碳水化合物代谢（13.25%）和氨基酸代谢（10.37%）丰度较高。三级代谢通路中，代谢通路（27.42–28.82%）、次级代谢产物生物合成（11.83–12.55%）占比最高。

通过Reporter Score算法比较优质与普通包包曲在贮藏1天和90天的代谢差异。贮藏1天时，优质包包曲的优势代谢通路包括苯丙氨酸代谢、多种抗生素生物合成、淀粉和蔗糖代谢等6条。贮藏90天时，优质包包曲的优势代谢通路增至19条，涵盖组氨酸代谢、卟啉代谢、氮代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、丁酸代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解等，表明优质包包曲在贮藏后期在氨基酸、有机酸和碳水化合物代谢方面更具优势。

4.4 不同质量包包曲贮藏过程中碳水化合物活性酶分析

通过与CAZy数据库比对，共鉴定出13,873个碳水化合物活性酶基因，分为六大类：糖苷水解酶（GHs，40.99%）、糖基转移酶（GTs，38.93%）、碳水化合物结合模块（CBMs，12.87%）、碳水化合物酯酶（CEs，2.76%）、辅助活性酶（AAs，3.86%）和多糖裂解酶（PLs，0.59%）。GHs作为优势酶类，表明包包曲具有作为糖化剂的潜力。

GH13家族是最主要的糖苷水解酶家族，包含α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶等，主要贡献微生物为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和米曲霉（Aspergillus oryzae）。GH1家族主要降解葡聚糖，含6-磷酸-β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。CE家族主要包括CE4和CE9，参与酯类和风味物质合成。

机器学习结合SHAP分析显示，显著区分优质与普通包包曲的前9个酶家族为GH43、GH31、GT9、GH2、CBM50、GH5、GH4、GT4和GT26，其中GH43、GH31、GH5和CBM50在优质包包曲中丰度更高。GH43家族主要参与半纤维素降解（如阿拉伯木聚糖和果胶），由1,4-β-木聚糖酶和内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶组成。GH31家族参与淀粉降解，主要含α-D-木糖苷酶和α-葡萄糖苷酶。GH5家族具强纤维素降解能力，含内切葡聚糖酶和1,3-β-葡萄糖苷酶。

5. 讨论与结论总结

讨论部分：本研究表明，优质包包曲在贮藏过程中微生物丰富度持续增加，而普通包包曲呈波动趋势，这为后续酿造提供了更丰富的菌群保障。优势菌属中，Staphylococcus的快速下降可能有利于包包曲品质提升，Weissella和Thermoactinomyces的上升则为关键代谢物（如丁酸）的产生提供了微生物资源。通过机器学习鉴定的关键微生物标志物中，Kluyveromyces marxianus在优质包包曲中的高丰度提示其具有增强α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶和纤维素酶活性的潜力；Thermoactinomyces vulgaris能产生多种酶类（如α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和脱氢酶），为发酵提供丰富的酶系和风味前体。代谢通路分析表明，优质包包曲在贮藏后期富集了更多与氨基酸、有机酸和碳水化合物相关的通路，这与游离氨基酸促进吡嗪、酯类等化合物合成的报道一致。酶学分析显示，GH43、GH31和GH5在优质包包曲中的高丰度反映了其在半纤维素、淀粉和纤维素降解方面的更强能力，有助于提高原料利用率。

结论翻译：包包曲的质量直接决定了白酒的品质和产量，并且在使用前必须经过贮藏陈化。然而，关于不同质量等级包包曲贮藏过程中微生物演替差异的研究较少。本研究采用宏基因组学方法和机器学习技术，利用多层感知器（MLP）神经网络模型结合SHapley Additive exPlanations（SHAP）方法，对不同等级包包曲贮藏过程中的微生物群落和酶谱进行了差异分析。结果表明，优质包包曲的微生物丰富度高于普通包包曲，优质包包曲注释到256个目、544个科、1764个属和6901个种，而普通包包曲为237个目、510个科、1656个属和6440个种。丰度最高的五个微生物属为Weissella、Staphylococcus、Thermoactinomyces、Limosilactobacillus和Pediococcus，合计占微生物总量的46.3%至87.1%。显著区分优质与普通包包曲的前十个关键微生物为Weissella confusa、Kluyveromyces marxianus、Staphylococcus lloydii、Staphylococcus warneri、Weissella paramesenteroides、Pediococcus pentosaceus、Thermoactinomyces vulgaris、Lactiplantibacillus plantarum、Saccharopolyspora rosea和Leuconostoc citreum，其中仅Pediococcus pentosaceus和Saccharopolyspora rosea在普通包包曲中含量更高，其余八个微生物在优质包包曲中丰度更高。分析还显示，预测的糖苷水解酶是主要酶类，占40.99%，表明包包曲具有作为糖化剂的潜力。显著区分优质与普通包包曲的前十个酶家族包括GH43、GH31、CE9、GT0、GH5、GT51、GT1、GT119、GT9和GH34，其中GH43、GH31、GH5、GT51、GT1和GT119在优质包包曲中丰度更高。本研究深入分析了不同质量等级包包曲贮藏过程中微生物和潜在酶谱的差异，为建立客观定量的质量评价体系提供了支持，也有助于优化包包曲的生产工艺和贮藏条件，从而进一步提高优质包包曲的比例。当然，本研究也存在一定局限性，未来可通过开展酶表达测试和风味组分测定加以弥补。