香山山脉土壤中分离的抗蜡样芽孢杆菌芽孢杆菌WHQ17的完整基因组组装与细菌素基因簇鉴定

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of Bacillus toyonensis WHQ17, a bacteriocin-producing strain isolated from soil of Xiangshan Mountain

　　摘要从香山山脉土壤分离得到的 *Bacillus toyonensis*（丰田芽孢杆菌）WHQ17 产生一种具有抗 *Bacillus cereus*（蜡样芽孢杆菌）特异活性的细菌素。本文报告了该菌的完整基因组，由一条染色体和五个质粒组成，并鉴定出三个推测的细菌素生物合成基因簇，以期为后续表征研究提供参考。公告*Bacillus toyonensis* 是一种革兰氏阳性、杆状、兼性厌氧、能产孢的细菌，广泛存在于自然环境及动物消化道中（1）。作为一种成熟的益生菌，该菌已在动物饲料中安全应用数十年（2、3）。近期研究重点关注其产生的细菌素，包括未修饰型细菌素 toyoncin（丰田菌素）和环肽细菌素 toyoncin WJY28，二者对食源性病原菌表现出强效、特异性的抗菌活性，在食品保鲜领域具有重要应用前景（4、5）。WHQ17 菌株分离自中国淮北香山国家森林公园土壤（33.99°N，116.81°E）：采用连续稀释涂布法，在胰蛋白大豆琼脂（TSA）平板上 25°C 培养 24 小时，并纯化获得单一菌落（图 1A）。采用琼脂孔扩散法（4）进行抑菌试验显示，WHQ17 产生一种高度特异性的抗 *Bacillus cereus* 活性物质，且其活性可被蛋白酶（α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，各 1 mg/mL）处理灭活，证实其属于细菌素性质（图 1B）。图 1 丰田芽孢杆菌 WHQ17 的特征。(A) 25°C、24 小时 TSA 平板上的菌落形态。(B) 无细胞上清液（CFS）对蜡样芽孢杆菌 CMCC 63303 的抑菌活性（琼脂孔扩散法）。CFS 由菌悬液在 TSB 中 25°C、200 rpm 振荡培养 8 小时后离心（12,000 rpm，10 分钟）获得。图示处理组包括：未处理的 CFS、经热灭活蛋白酶混合物处理的 CFS、以及经有活性蛋白酶混合物处理的 CFS。蛋白酶处理后抑菌圈消失，表明该抑菌物质属于细菌素。(C) 预测的细菌素生物合成基因簇（lassopeptide、Lactococcin_972 家族及 lanthipeptide）及其前体肽与最相似的已知细菌素的序列比对，分别为 PadA（paeninodin）、LclA（Lactococcin_972）和 EnwA（enterocin W α 亚基）。基因组 DNA 提取自 TSB 过夜培养液，使用 TaKaRa MiniBEST Kit v3.0 试剂盒，约获得 30 μg 基因组 DNA；其中 1 μg 用于 Illumina 测序文库构建，5 μg 用于 Oxford Nanopore Technology（ONT）文库构建。ONT 测序直接利用所提取的基因组 DNA，未经剪切或片段大小筛选。文库采用 SQK-RBK004 Rapid Barcoding Kit 试剂盒构建，并在 MinION 测序仪上使用 FLO-MIN106D 流动芯片进行测序。使用 Guppy v6.2.1 进行碱基预测，共获得 156,653 条 reads（N50 为 18,327 bp，总数据量为 2.183 Gb）。Illumina 测序则采用 Covaris LE220R-plus 仪器剪切基因组 DNA，随后使用 AMPure XP 磁珠进行片段大小选择（未使用专门的片段大小筛选仪器）。文库使用 NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit 试剂盒构建，并在 NovaSeq 6000 平台上（S4 Reagent Kit）进行测序，获得 150 bp 双端原始 reads。原始 reads 使用 fastp v1.3.6（6）进行预处理，得到 8,457,250 条清洁 reads（1.268 Gb）。混合组装采用 Unicycler v0.4.9（7），随后使用 Racon v1.4.20（8）和 Pilon v1.24（9）进行校正。除特别说明外，所有工具均使用默认参数运行。最终组装基因组包含六个环状复制子，即一条染色体和五个质粒。循环性由 Unicycler 通过闭环路径进行评估；染色体的起始位置被旋转至推测的 *dnaA* 基因处，而质粒未作旋转，原因是不存在 *repA* 同源基因。使用 PGAP v6.11（10）进行注释，预测共有 6,303 个蛋白编码基因、106 个 tRNA 和 42 个 rRNA（表 1）。通过 GGDC 3.0（12）和 EzBioCloud ANI Calculator（13）计算，WHQ17 与模式菌株 *B. toyonensis* P18（GCF_016605985.1）之间的 dDDH 和 ANI 值分别为 86.80% 和 98.65%，远高于种水平阈值（dDDH 70%，ANI 96%）（11），确认 WHQ17 属于 *B. toyonensis*。采用 BAGEL4（14，默认参数）和 antiSMASH（15，relaxed 模式）分析，共预测出三个推测的细菌素生物合成基因簇，分别对应 lasso 肽、Lactococcin_972 家族细菌素和 lanthipeptide（图 1C）。预测的前体肽与其最接近的已知同源物相似性较低，可能正是观察到抑菌活性的来源。后续研究将聚焦于这些细菌素的鉴定及其作为天然防腐剂抗 *B. cereus* 的潜力评估。表 1 丰田芽孢杆菌 WHQ17 的基因组特征| 片段 | 长度（bp） | G+C 含量（%） | 基因数 | tRNA 数 | rRNA 数 | 细菌素 BGC 数量及类型 | 登录号 ||---|---|---|---|---|---|---|---|| 染色体 | 5,333,284 | 35.49 | 5,506 | 106 | 42 | 1 个 lasso 肽 | JCBIIR010000001.1 || 质粒 1 | 501,947 | 32.97 | 469 | 0 | 0 | 0 | JCBIIR010000002.1 || 质粒 2 | 266,359 | 32.56 | 248 | 0 | 0 | 1 个 Lactococcin_972 家族细菌素 + 1 个 lanthipeptide | JCBIIR010000003.1 || 质粒 3 | 51,457 | 33.71 | 57 | 0 | 0 | 0 | JCBIIR010000004.1 || 质粒 4 | 10,517 | 30.63 | 12 | 0 | 0 | 0 | JCBIIR010000005.1 || 质粒 5 | 10,182 | 27.86 | 11 | 0 | 0 | 0 | JCBIIR010000006.1 || 总计 | 6,173,746 | 35.12 | 6,303 | 106 | 42 | 3 | JCBIIR000000000.1 |致谢本研究得到安徽省教育厅自然科学研究项目（2022AH030055）、农业微生物国家重点实验室开放基金（AMLKF202306）以及校企合作项目（2025340603000002）的支持。