ε-聚赖氨酸盐酸盐和二乙酰酸钠对伤寒沙门氏菌的协同抗菌活性

《Food Bioscience》：Synergistic antibacterial activities of ε-polylysine hydrochloride and sodium diacetate against Salmonella Typhimurium

　　

摘要
本研究调查了ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐（ε-PL）和双乙酰酸钠（SDA）对受试鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）菌株的协同抗菌活性及机制。使用最低抑菌浓度（MIC）、棋盘法和时间-杀菌曲线评估了ε-PL和SDA对S. Typhimurium的抗菌活性。通过细菌形态、生物膜形成、运动性、碱性磷酸酶（AKP）泄漏、膜电位、呼吸链脱氢酶活性以及鸡胸肉丸在冷藏储存期间的实际应用效果，评估了低剂量ε-PL-SDA组合对S. Typhimurium的协同抗菌机制和实际应用效果。ε-PL和SDA对S. Typhimurium的MIC值分别为0.1875 mg/mL和1.5 mg/mL。棋盘法分析显示ε-PL（1/8 MIC）和SDA（1/64 MIC）之间存在强协同作用。扫描电镜（SEM）显示ε-PL-SDA组合导致细胞形态严重损伤。ε-PL-SDA组合抑制了S. Typhimurium在玻璃片上的生物膜形成，降低了发育期和成熟期生物膜的生物量及活菌数。与对照组、单独使用ε-PL或SDA相比，ε-PL-SDA组合诱导了S. Typhimurium最高的AKP泄漏，表明细胞包膜完整性受到破坏。此外，ε-PL-SDA组合使S. Typhimurium的膜电位降低了44.4%，呼吸链脱氢酶活性降低了75.1%。在鸡胸肉丸中，ε-PL-SDA组合将S. Typhimurium的生长抑制到储存12天时的7.8 log10 CFU/g，而对照组为10.1 log10 CFU/g，同时维持了pH值、白度和整体接受度。因此，ε-PL-SDA组合显示出作为低剂量抗菌策略针对受试S. Typhimurium菌株的潜力。

引言
农业和食品系统中的沙门氏菌污染是一个全球性的重大关切问题（Galan-Relano等，2023）。这种污染会损害食品安全和质量，可能导致食品损失和浪费，并在食品生产和供应链中造成经济负担（Papoula-Pereira等，2025）。此外，受S. Typhimurium污染的食品因其可能引起食源性疾病和食源性疾病暴发，对食品安全和公共卫生构成持续威胁（Omer等，2018）。

一方面，沙门氏菌可能污染世界各地的各种食品，特别是肉类产品，如鸡肉、猪肉、牛肉及其衍生加工产品（Chlebicz等，2018；Zhang等，2021）。Loor-Giler等（2025）分析了从厄瓜多尔皮钦查和曼塔省收集的600个样本，报道了生奶中沙门氏菌的总体流行率为37.5%（225/600），其中优势血清型分别为鼠伤寒沙门氏菌（10.30%）、肠炎沙门氏菌（10%）、副伤寒沙门氏菌（5.33%）和伤寒沙门氏菌（4.67%）。Yang等（2026）调查了中国食品样本中沙门氏菌的流行情况，2011-2016年间3,570个样本中有15.4%的沙门氏菌阳性样本，其中禽肉中流行率最高（20.5%），其次是畜肉（19.5%）和水产品（16.7%）。

此外，沙门氏菌污染可能导致食品腐败变质，造成食品浪费和食品供应链中的重大经济损失（Gram等，2002；Jin和Xu，2025c；Jin和Xu，2025d）。2000-2012年间，美国受FSIS监管的机构因沙门氏菌污染共召回1.33亿磅产品，导致食品资源大量损失，同时防止了估计约8,300例沙门氏菌疾病的发生（Seys等，2017）。Cavallaro等（2011）报道，鼠伤寒沙门氏菌污染导致3,918种花生制品被召回，这是2008-2009年期间历史上最大的食品召回事件之一，在美国造成估计10亿美元的经济损失。2011年，美国有3,600万磅受海德尔堡沙门氏菌污染的火鸡肉馅被召回（Routh等，2015）。最近的估计表明，美国非伤寒沙门氏菌每年造成约171亿美元的经济损失，是食源性病原体中经济负担最重的（Hoffmann等，2025）。

另一方面，食品中沙门氏菌污染引发了全球范围内的食源性疾病暴发，导致住院甚至死亡，对食品安全和公共卫生构成持续威胁（Liu等，2019）。2010年，在全球约6亿例食源性疾病和42万人死亡中，非伤寒沙门氏菌占了食源性疾病相关死亡的大部分比例（Havelaar等，2015）。在美国，食源性非伤寒沙门氏菌每年导致约103万例感染、19,300例住院和378例死亡（Scallan等，2011）。与美国Foster Farms鸡肉产品相关的多州海德尔堡沙门氏菌暴发导致634例确诊病例和大量住院（Etter等，2019）。2024年，美国疾病控制与预防中心报道，与禽类相关的沙门氏菌暴发在美国记录了1,072例疾病和247例住院，以及因间接接触禽类导致的婴儿沙门氏菌病病例（Ladd-Wilson等，2024）。

为减少食品中的沙门氏菌污染，各种控制策略和化学防腐剂已广泛应用于食品生产过程中。然而，过度使用化学防腐剂引发了对潜在消费者健康风险和环境影响的日益关注，这对食品系统的长期可持续性构成了重大挑战（Jin和Xu，2025a；Lemoni等，2025）。Xiao等（2023）报道，苯甲酸钠摄入过量可能会引起氧化应激和代谢紊乱，从而导致肠道菌群失调，进一步导致葡萄糖代谢障碍和血糖水平升高。广泛用于腌肉制品的亚硝酸盐在酸性胃条件下可与胺反应，形成具有潜在致癌性的N-亚硝胺。超过法规限制的过量摄入可能对 human 体构成潜在风险（Honikel，2008）。Ning等（2019）报道，长期暴露于山梨酸钾会对人外周血淋巴细胞产生基因毒性效应。Mamur等（2010）报道，山梨酸钾处理导致人外周血淋巴细胞DNA链断裂，并增加了染色体畸变和姊妹染色单体交换，表明其在长期或高浓度暴露条件下具有潜在基因毒性。

天然安全的抗菌剂作为控制食品中沙门氏菌污染的有前途的替代品，已引起广泛关注。ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐（ε-PL）是白色链霉菌产生的一种天然阳离子抗菌肽，因其广谱抗菌活性而作为一种安全食品防腐剂被广泛使用（Nochi等，2021）。Sundaran等（2022）报道了ε-PL对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的广谱抗菌特性，包括铜绿假单胞菌PAO1、肺炎克雷伯菌CG43、MET敏感的金黄色葡萄球菌（S. aureus）和MET耐药的S. aureus。

双乙酰酸钠（SDA）被认为是有前途的传统防腐剂替代品，可延长食品的保质期，因其具有强抗菌活性和低细胞毒性。据报道，通过使用MTT assay和流式细胞术评估SDA的细胞毒性，SDA不会引起人脐静脉内皮细胞的显著死亡，表明其具有低细胞毒性（Mohammadzadeh-Aghdash等，2018；Redondo-Solano等，2021）。然而，食品中使用的相对高剂量ε-PL不仅增加了生产成本，还产生了不良的苦味，限制了消费者接受度和在食品防腐中的应用（Sun等，2018）。同样，使用相对高浓度SDA可能会产生不良的酸味和颜色变化，对食品质量产生不利影响，从而限制了其在食品中的可行应用（Michaelsen等，2006）。

为解决这些局限性，低剂量防腐剂组合作为一种既能减少防腐剂用量又能保持有效抗菌活性的有前途策略应运而生。因此，阐明这种有效的低剂量协同机制将有助于开发具有改善感官特性的保存策略，支持其在食品中的实际应用（Jin和Xu，2025b；Xu等，2022）。通过开发抗菌策略、减少与过度使用防腐剂相关的担忧并提高资源使用效率，这些方法有助于实现更可持续的食品保存和食品生产系统（Jin和Xiaojie，2025；Jin等，2026）。据报道，ε-PL与石榴皮鞣质组合对大肠杆菌表现出抗菌活性，并将ε-PL的MIC从15 μg/mL显著降低至3.75 μg/mL，石榴皮鞣质从2500 μg/mL降低至625 μg/mL。ε-PL/石榴皮鞣质组合将牛肉保质期从4天延长至8天，第6天的活菌数为2.52 ×107 CFU/g，低于对照组（2.5 ×1010 CFU/g）（Xu等，2025）。Zeng等（2024）报道，那他霉素（0.1 g/L）和ε-PL（0.4 g/L）也增强了抗菌活性，抑制了鲜切菠萝蜜中总菌数的增长，与单独使用ε-PL或那他霉素相比，鲜切菠萝蜜的质量更好，如降低失重率、保持抗氧化能力和抑制呼吸速率。

SDA（0.2%）和乳酸钠（2.5%）的组合有效抑制了单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌的生长。在5°C储存期间，该组合使单核细胞增生李斯特菌的活菌数从3.30降至2.80 log CFU/g，沙门氏菌从3.60降至2.85 log CFU/g，20天后两种病原体均降至30天储存后无法检测到的水平（Mbandi等，2002）。Jung等（2009）显示，SDA与ε-PL和乳酸钾（1.5-4.5%乳酸钾/SDA混合物，w/v）组合可有效抑制肉汤和鸡肉饼中S. Typhimurium的生长。此外，Qiu等（2026）报道，1 MIC的ε-PL与3 MIC的SDA组合对液化产碱杆菌具有协同抗菌活性。

然而，尚无文献报道ε-PL-SDA组合对S. Typhimurium的协同抗菌活性、抗菌机制以及在食品基质中的感官应用。因此，本研究旨在使用最低抑菌浓度（MIC）、棋盘法、生长曲线试验和时间-杀菌试验评估ε-PL和SDA对S. Typhimurium的协同抗菌活性。通过检查细胞形态、运动性、生物膜形成、细胞包膜完整性、外膜通透性、膜电位、胞内酸化以及呼吸链脱氢酶活性，研究了低剂量ε-PL-SDA组合对S. Typhimurium的协同抗菌机制。此外，在冷藏储存期间，基于活菌数、pH值、白度和整体接受度评分，进一步评估了低剂量ε-PL-SDA组合在鸡胸肉丸中对S. Typhimurium的实际应用效果。

章节摘要
材料
S. Typhimurium购自中国齐鲁工业大学菌种保藏中心。ε-PL、SDA、罗丹明123、戊二醛（50%）、2,3,5-三苯基四氮唑氯化物和4-硝基苯磷酸二钠六水合物（PNPP）购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。酵母提取物、胰蛋白胨和琼脂粉购自北京奥博星生物科技有限公司（中国北京）。NaCl、乙醇、考马斯亮蓝（R-250）、磷酸缓冲液

ε-PL和SDA的MIC值以及ε-PL和SDA对S. Typhimurium的协同抗菌效果
培养管的可见浑浊被解释为细菌生长的指标，而其可见清澈则表示无可观察到的生长，这也是通过测量培养管的OD600值进一步确定的，作为MIC值确定的依据。如图1(a)和表1所示，用0.09375 mg/mL ε-PL处理的样本呈浑浊状，而用0.1875 mg/mL ε-PL处理的样本呈清澈状，OD600值分别为0.4593和0.1936。存在显著差异

结论
在本研究中，ε-PL和SDA对受试S. Typhimurium菌株表现出协同抗菌活性。ε-PL和SDA的组合显著破坏了S. Typhimurium的保护屏障，包括生物膜、细胞包膜和细胞膜。生物膜形成的初期阶段与细菌运动性密切相关。ε-PL-SDA组合显著抑制了游泳运动和群体运动，进一步阻碍了S. Typhimurium的生物膜形成。ε-PL和

CRediT作者贡献声明
Yan Liang：调查。
Gui-Jin Sun：调查。
Jie Yang：调查、形式化分析。
Ying-Qiu Li：写作 - 审阅和编辑、方法论、资金获取、概念构思。
Chen-Ying Wang：调查、形式化分析。
Feng Wang：写作 - 原稿、调查、形式化分析。
Wei-Na Zhang：调查、形式化分析。

未引用参考文献
Aslan和Alim，2025；Chlebicz和Slizewska，2018；Copeland和Weibel，2009；Geornaras和Sofos，2006；Haiko和Westerlund-Wikstr?m，2013；Helander和Mattila-Sandholm，2000；Jin和Xu，2026；Lambert和Stratford，1999；Liu等，2015；Mahdavi和Aliakbarlu，2024；Mbandi和Shelef，2002；Xu和Zhang，2022；Zhang和Xu，2021。

伦理声明
已征得所有参与者或其法定代表人的书面知情同意，同意参与研究并发表文章。参与者的隐私权已得到尊重。

本研究按照研究地点的相关法律、法规框架和指南进行。根据相关法律和机构指南，本研究不需要伦理委员会批准。

本感官评价无需获得伦理委员会批准。利益冲突声明：作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。致谢：本工作得到齐鲁工业大学（山东省科学院）科教融合创新发展重大试点项目（项目编号：2026ZDCX10、2025ZDZX15）的资助。