# 基于杂交链式反应扩增的FRET适配体传感器用于牛奶中金黄色葡萄球菌的高灵敏检测

《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Hybridization chain reaction-based aptasensor for sensitive detection of Staphylococcus aureus in milk

　　

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）作为引发食品安全事件的重要病原菌之一，其快速、准确检测一直是食品安全监管领域的研究热点与技术难点。传统方法如培养法、免疫学检测及分子生物学技术虽应用广泛，但各有局限：平板计数法作为细菌检测的"金标准"需耗时48–72 h；免疫学方法（如酶联免疫吸附测定，ELISA；侧向流动免疫层析，LFIA）依赖抗体，其制备周期长达3–6个月且成本高昂，并在牛奶等复杂食品基质中易发生非特异性结合；聚合酶链式反应（PCR）依赖精密热循环仪器及琼脂糖凝胶电泳后处理，实时荧光定量PCR（qPCR）则需昂贵仪器及专业人员。为克服上述不足，研究人员构建了一种基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）的适配体传感器，创新性地将适配体功能化磁珠（magnetic beads, MBs）与杂交链式反应（hybridization chain reaction, HCR）扩增相结合，用于牛奶中S. aureus的灵敏检测。该方法采用化学合成适配体替代抗体，具有成本低、批间一致性好等优势；与CRISPR及LAMP等技术相比，该方法在等温、无酶条件下运行，无需热循环仪或额外蛋白组分；更重要的是，区别于以往仅在均相溶液中依赖信号扩增的HCR传感器，该设计引入MB介导的细菌富集与靶标触发的HCR引发链释放，经FRET荧光读出，有效提升了灵敏度并抑制基质干扰。该工作为生物传感器设计提供了新思路，在食品安全与环境监测领域具有重要应用潜力。

研究背景表明，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）作为重要食源性致病菌，其传统检测方法存在耗时长、依赖抗体、需精密仪器或易产生非特异性信号等瓶颈。为此，研究人员开发了一种整合适配体功能化磁珠（MBs）与杂交链式反应（HCR）扩增的FRET荧光适配体传感器。关键技术方法包括：（1）基于环氧基磁珠与氨基修饰适配体的共价偶联构建MBs-Apt复合物；（2）通过触发链（Tri）与适配体预杂交构建MBs-Apt-Tri传感器，目标菌识别后触发Tri释放；（3）利用荧光标记的发夹探针HP1（FAM/BHQ-1标记）与HP2，在Tri引发下进行无酶等温HCR扩增，产生FRET信号恢复；（4）采用磁分离实现靶标富集与基质干扰去除。样本队列来源为市售超高温瞬时灭菌（UHT）牛乳，人工加标制备模拟污染样本。优化条件包括捕获时间（30 min）、MBs-Apt浓度（600 nM）、传感器用量（30 μL）、HP1/HP2比例（1:2）及HCR反应时间（45 min）。方法学验证包括NUPACK模拟、凝胶电泳表征及实际样品加标回收实验。

**研究结果**

**3.1 S. aureus检测原理**

研究人员通过凝胶电泳逐步验证了传感机制：适配体与触发链成功杂交形成Apt-Tri双链；目标菌S. aureus与适配体结合后诱导构象变化，特异性释放Tri链；释放的Tri在HP1与HP2存在下启动级联HCR，形成高分子量荧光聚合物。对照实验排除了无Tri时HP1被直接打开及自发杂交的可能，且HCR扩增体系产生的荧光信号为非扩增对照组的5倍以上，证实了HCR在信号增强中的关键作用。

**3.2 NUPACK模拟核酸序列表征**

通过NUPACK软件模拟，HP1与HP2的自由能分别为?15.65 kcal/mol和?17.44 kcal/mol，两者处于亚稳态，既避免无Tri时非预期解链或杂交，又能在Tri存在下被高效打开。HCR级联产物自由能低至?56.63 kcal/mol，热力学上驱动反应向产物方向进行。HP1标记FAM/BHQ-1后形成稳定的茎环结构（自由能?26.37 kcal/mol），Tri结合后转变为线性构象（自由能0.00 kcal/mol），荧光团与淬灭剂分离实现荧光恢复。模拟结果证实了检测方法设计的可行性。

**3.3 实验条件优化**

（1）捕获时间：在102 CFU/mL S. aureus下，30 min时上清残余菌落最少、MBs-Apt捕获菌落最多，捕获效率约40%，为最优结合平衡点。（2）MBs-Apt浓度：在102 CFU/mL菌量下，300 nM即可实现>90%捕获效率；而在104 CFU/mL菌量下需600 nM才能达到约90%捕获效率。3 mg MBs的适配体固定效率约49.6%，载量为11.48 pmol/mg。三批次独立捕获实验效率分别为99.71%、99.95%和99.66%。（3）MBs-Apt-Tri用量：荧光信号在30 μL时达到最大，无触发链的对照组荧光强度与空白对照相当，排除了HP1/HP2自发杂交的背景干扰。（4）HP1/HP2比例：1:2时荧光显著增强，继续增大比例仅轻微提升，综合信号响应与成本选择1:2。（5）HCR反应时间：45 min时低浓度菌（101 CFU/mL）已可产生可区分的荧光信号，且与60 min信号相当，故选择45 min。

**3.4 S. aureus检测**

在最优条件下，荧光强度随S. aureus浓度（101–105 CFU/mL）呈浓度依赖性增加，线性回归方程y = 20.58x + 63.57，R2 = 0.9895，检测限（LOD）为5.3 × 10¹ CFU/mL（S/N = 3）。三批次独立制备的传感器对104 CFU/mL S. aureus的荧光响应RSD为2.12%（n = 3），表明制备工艺重现性良好。存储稳定性试验表明，MBs-Apt在4°C储存7天内适配体无明显脱落，可提前制备；但完整MBs-Apt-Tri传感器储存3、5、7天后荧光强度分别保留71%、64%和39%，建议现配现用或24 h内使用。

**3.5 特异性分析**

以106 CFU/mL浓度分别测试S. aureus、大肠埃希菌8099（E. coli 8099）、大肠埃希菌O157:H7（E. coli O157:H7）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及鼠伤寒沙门菌（S. typhimurium），结果表明所有非靶菌株（含MRSA）的荧光信号均与阴性对照相当，仅靶标S. aureus产生显著响应。磁珠捕获实验显示MBs-Apt对S. aureus的捕获效率>90%，而对其余测试菌株均低于10%，与荧光特异性结果一致，证实该方法对靶标菌株具有高度特异性。

**3.6 实际样品检测**

采用市售UHT灭菌牛乳进行加标回收实验，S. aureus加标浓度为1.0 × 10²、1.0 × 10³和1.0 × 10⁴ CFU/mL时，回收率范围为94%–110%，相对标准偏差（RSD）为1.07%–3.89%。尽管UHT乳中含有与生乳相似的蛋白质和脂肪，但HCR级联指数扩增有效抑制了残留基质干扰，保证了高信噪比。该方法总检测时间约15.5 h，显著短于平板计数法的24–48 h，灵敏度超过多数qPCR方法（通常为10²–10³ CFU/mL），且无需热循环仪及核酸提取步骤。

**讨论与结论**

讨论部分指出，当前方法在灭菌乳中验证效果良好，但天然污染原料乳中的固有微生物群及更复杂的胶体结构可能引入额外变量，未来需采用天然污染原料乳样本并与平板计数法或qPCR交叉验证。本研究的局限包括：适配体针对特定S. aureus菌株筛选，可能因表面表位表达差异而呈现菌株依赖性结合亲和力；该基于适配体的识别不依赖细胞代谢活性，无法区分活菌与死菌，但在灭菌乳制品中S. aureus被国家标准严格禁止，无论死活菌的存在均提示潜在污染，不影响筛查应用价值。

研究结论为：研究人员成功开发了一种整合适配体功能化磁珠与HCR信号放大的荧光适配体传感器，用于S. aureus的快速检测。通过结合高效磁富集与无酶等温扩增，该方法规避了传统方法需要复杂仪器或长时间分析的问题。在最优条件下，该方法表现出优异特异性，即使在非靶细菌浓度高达10⁶ CFU/mL时也能可靠区分。综上所述，该工作为S. aureus提供了一种快速、灵敏、高特异的检测策略，凸显了相较于传统方法的显著优势，并为复杂食品基质及环境样品中多种目标物的分析提供了有前景的平台。