饮食来源植物细胞外囊泡中的部分微RNA在胃肠消化后仍可被检测到，并在CaCo-2细胞模型中表现出上皮摄取能力

《Food Chemistry: Molecular Sciences》：A fraction of diet-derived microRNAs present in plant extracellular vesicles remain detectable after gastrointestinal digestion and shows epithelial uptake in a CaCo-2 cell model

　　

饮食被认为是调节健康和疾病的主要因素之一。微RNA（microRNAs， miRNAs）作为饮食中的新型生物活性成分引起了人们的兴趣。然而，关于它们在烹饪和胃肠消化（gastrointestinal digestion， GID）过程中的稳定性，以及它们在肠道上皮中的细胞摄取和转运机制，仍存在巨大的知识空白。本研究旨在探究花椰菜（Brassica oleracea var. botrytis）中内源性miRNA在模拟烹饪和体外静态INFOGEST 2.0消化模型中的命运。研究人员评估了总RNA、小RNA及特定miRNA（bol-miR172a、bol-miR164b、bol-miR156a和bol-miR1030i）的稳定性。此外，研究人员还从生花椰菜和消化后的生物可利用相中纯化了植物细胞外囊泡（plant extracellular vesicles， PEVs），并对其进行了表征。最后，利用分化的CaCo-2单层细胞模型研究了这些miRNA的细胞摄取和基底外侧分泌情况。结果显示，大部分RNA在烹饪和GID过程中被降解。然而，一小部分miRNA（低于1%）在消化后仍可被检测到。与未包裹的miRNA相比，包裹在PEVs中的miRNA对GID表现出更强的抵抗力。在消化的生物可利用相中，约1-10%的PEVs保持完整。在CaCo-2细胞模型中，时间、浓度和纳米封装（如使用Lipofectamine）均能促进miRNA的摄取。此外，当miRNA包裹在PEVs中时，其向基底外侧的分泌似乎也得到了促进。总之，本研究表明，尽管大多数饮食来源的RNA在消化过程中被降解，但一小部分与PEVs相关的miRNA能够存活下来，并被肠道上皮细胞摄取甚至转运。这些发现为饮食来源miRNA作为潜在生物活性化合物的假说提供了支持，并为未来研究其在肠道局部乃至全身的生物学效应奠定了基础。

论文解读文章

1. 研究背景与科学问题

饮食是影响人类健康与疾病的关键环境因素之一。近年来，除了传统的次级代谢产物，饮食中的核酸类物质，特别是微RNA（microRNAs， miRNAs），因其潜在的跨物种基因调控能力而成为研究热点。“饮食源异种miRNA假说”（dietary xenomiR hypothesis）提出，食物中的外源性miRNA可能进入人体并发挥生物学功能。然而，这一领域的研究进展缓慢，主要面临三大瓶颈：

首先，饮食源miRNA在经历厨房加工（如烹饪）和复杂的胃肠消化（gastrointestinal digestion， GID）过程后的稳定性尚不明确。现有研究设计常存在缺陷，例如使用粪便样本评估稳定性或省略关键的消化步骤。其次，miRNA在肠道上皮细胞的摄取和转运机制，特别是其是否依赖于植物细胞外囊泡（plant extracellular vesicles， PEVs）的保护和递送作用，缺乏系统性研究。最后，关于饮食源miRNA能否被吸收进入体循环的证据相互矛盾，许多研究未能检测到其在血浆等体液中的存在。因此，系统阐明饮食源miRNA从食物基质到肠道细胞的整个命运链条，对于验证其作为新型膳食生物活性成分的潜力至关重要。

2. 研究设计与核心方法

为解决上述问题，研究人员采用了一套整合性的体外实验方案：

1. 1.
   样品制备与消化模型：以新鲜花椰菜（Brassica oleracea var. botrytis）为模型食物。样品分为生样（RC）、煮样（CC）、消化样（DC）和煮熟后消化样（CDC）。GID严格按照国际通用的静态INFOGEST 2.0标准模型进行，并设置了轻度（MDC）和重度（SDC）两种变体以模拟个体差异。
2. 2.
   PEVs的分离与表征：分别从生花椰菜（RC-E）和消化后生物可利用相（DC-E）中，使用商业化ExoEasy Maxi Kit基于膜亲和层析的原理纯化PEVs。随后通过动态光散射（dynamic light scattering， DLS）测定粒径、多分散性指数（PDI）和zeta电位；通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy， TEM）观察形态；并使用免疫印迹法（Western blot）检测PEVs表面标志蛋白（PEN1/SYP121和TET8）。
3. 3.
   RNA提取与定量分析：使用不同的商业化试剂盒（如miRNeasy系列、ExoRNEasy系列）从不同样品中提取总RNA。通过Qubit荧光计测定总RNA和小RNA浓度，并通过毛细管电泳分析片段长度分布。采用特异性miRCURY LNA RT-qPCR技术，对选定的四个花椰菜miRNA（bol-miR172a、bol-miR164b、bol-miR156a和bol-miR1030i）进行绝对或相对定量分析。
4. 4.
   细胞摄取与转运实验：使用人结直肠腺癌细胞系CaCo-2作为肠道上皮模型。在非极化和极化（Transwell小室）两种培养条件下，将细胞暴露于合成的miRNA模拟物（mimic）、花椰菜总RNA提取物或纯化的PEVs中。通过检测细胞内和基底外侧培养基中的bol-miR172a水平，评估其细胞摄取/吸附和跨细胞转运效率。同时使用Lipofectamine 3000模拟人工纳米封装效果。

3. 主要研究结果

3.1 微RNA在加热孵育和胃肠消化后可被检测

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  总RNA与小RNA含量变化：通过Qubit定量分析发现，无论是烹饪还是消化，都导致总RNA和小RNA浓度急剧下降（降幅达93.90-99.98%）。消化后的小RNA占总RNA比例显著升高（超过100%），表明长链RNA被大量降解，而小RNA相对富集。
• •
  miRNA特异性检测：通过RT-qPCR检测，在四个目标miRNA中，只有bol-miR172a在模拟GID后仍能被检测到，但其存活率仅为原始生样（RC）的0.003%。其他三种miRNA（bol-miR164b、bol-miR1030i和bol-miR156a）在消化后均无法检出。
• •
  RNA片段分析：毛细管电泳结果显示，消化后的样品中，RNA片段主要集中在20-100核苷酸（nt）的短片段区域，而原始样品则含有更长的RNA分子，进一步证实了GID对长链RNA的降解作用。

3.2 不同消化模型对miRNA稳定性的影响

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  通过比较轻度和重度两种消化模型，研究发现重度消化条件（SDC）下，总RNA、小RNA和bol-miR172a的检测信号反而更高。这可能是因为更剧烈的酶解条件释放了更多原本与食物基质结合的miRNA，或消除了更多抑制后续RT-qPCR反应的杂质。
• •
  然而，所有消化后样品的质量控制指标（如外源spike-in对照的回收率不佳，A₂₃₀处吸光度异常高）表明样品中存在严重的污染物干扰，因此这部分数据被定性为探索性结果。

3.3 胃肠消化前后植物细胞外囊泡的表征

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  物理化学性质：DLS测量显示，消化前PEVs（RC-E）的平均水动力学直径为130.8 nm，消化后（DC-E）显著增大至203.3 nm。两者均呈单分散性（PDI≈0.2）。TEM图像确认了RC-E和DC-E中均存在直径约40-100 nm的球形脂质双层结构，但DC-E常聚集成团。
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  蛋白质与miRNA含量：BCA法和免疫印迹显示，DC-E的总蛋白含量和PEVs标志蛋白SYP121的信号均远低于RC-E。然而，在归一化到颗粒数量后，两者的蛋白含量无统计学差异。更重要的是，所有四种目标miRNA（bol-miR172a、bol-miR164b、bol-miR156a和bol-miR1030i）在DC-E中均能被检测到，尽管其浓度仅为RC-E的0.05%-0.24%，显著低于在总消化液（DC）中的检出率。这表明PEVs确实为其内部的miRNA提供了额外的保护。

3.4 CaCo-2细胞对miRNA摄取的测量

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  剂量依赖性与封装效应：在非极化CaCo-2细胞中，bol-miR172a的细胞关联量与孵育浓度成正比。直接添加花椰菜总RNA提取物无法检测到细胞内的miRNA，但使用Lipofectamine进行人工纳米封装后，无论是miRNA模拟物还是RNA提取物，都能在细胞内被高效检测到，提升倍数高达39.4倍。
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  PEVs介导的摄取：在极化CaCo-2细胞中，无论是来自生花椰菜的RC-E还是来自消化液的DC-E，均能导致细胞内检测到bol-miR172a。RC-E的摄取呈现浓度依赖性，而DC-E的摄取信号虽弱但可重复。延长孵育时间（从4小时增至6小时）并未显著增强DC-E的摄取。

3.5 基底外侧转运

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  在极化CaCo-2细胞模型中，所有处理组在基底外侧培养基中均能检测到微量的bol-miR172a，但其信号通常比细胞内信号延迟多个循环（即浓度更低）。只有在高浓度RC-E处理组，基底外侧的检测信号才出现在35个循环之前。
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  Lipofectamine虽然增强了miRNA的细胞摄取，但并未显著促进其向基底外侧的分泌。与细胞内的高重现性不同，基底外侧的检测值在不同实验间显示出较大的变异性。

4. 总结与讨论

本研究通过严谨的体外实验体系，系统地追踪了饮食来源miRNA从食物基质到肠道细胞的完整路径。研究结论可概括如下：

1. 1.
   稳定性有限但存在保护机制：绝大多数饮食来源的RNA在烹饪和GID过程中被降解，这构成了一个强大的生物屏障。然而，一小部分（<1%）特定的miRNA，尤其是那些被包裹在植物细胞外囊泡（PEVs）中的miRNA，能够在消化后存活下来。PEVs的脂质双层结构为其内部miRNA提供了物理和酶学上的保护。
2. 2.
   肠道上皮摄取与转运的证据：研究首次证明，经过GID后存活的PEVs及其携带的miRNA，能够被人肠道上皮细胞（CaCo-2模型）摄取/吸附。这种摄取过程受到浓度和时间的影响，并且包裹在PEVs中或通过人工纳米封装可以显著提高摄取效率。此外，有证据表明这些miRNA可以被转运至细胞的基底外侧，提示其可能具有穿越肠道屏障的潜力，尽管效率很低。
3. 3.
   研究的局限性：研究也指出了若干局限性和需谨慎解读之处。例如，消化后样品中的污染物影响了部分定量数据的准确性；在细胞实验中，检测到的信号可能部分源于细胞表面的吸附而非真正的胞内摄取；基底外侧的转运效率极低，其生理学意义有待商榷。此外，研究未能检测到饮食源miRNA在体循环中的存在，这与一些阴性报道一致。

综上所述，本研究为“饮食源异种miRNA假说”提供了重要的实验支持，特别是阐明了PEVs在保护miRNA免受消化降解和促进其肠道摄取中的关键作用。研究结果强调了未来研究应聚焦于PEVs作为天然纳米递送载体的潜力，并指出探讨饮食源miRNA在肠道局部发挥免疫调节或其他生物学功能的可能性，可能比追求其在全身系统中的效应更具现实意义。