《Food Chemistry: X》：Roasting-induced changes in the metabolite profile of laver (
Neopyropia yezoensis): Focus on mycosporine-like amino acids and antioxidant activity
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本研究探讨了紫菜（Neopyropia yezoensis）在不同温度/时间条件下焙烤后非挥发性代谢物的变化。基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）的代谢组学分析共鉴定出69种代谢物，包括类菌孢素氨基酸（MAAs）及其脱水衍生物。多
本研究探讨了紫菜（Neopyropia yezoensis）在不同温度/时间条件下焙烤后非挥发性代谢物的变化。基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）的代谢组学分析共鉴定出69种代谢物，包括类菌孢素氨基酸（MAAs）及其脱水衍生物。多变量分析表明，脱水MAAs是响应焙烤的关键代谢物之一。随着焙烤强度的增加，MAAs含量降至初始值的0.08倍，而脱水MAAs增加了1.22至13.61倍。抗氧化活性随之增强，其中ABTS+自由基清除活性和铁离子还原抗氧化能力（FRAP）的最大增幅分别为4.55倍和4.18倍。皮尔逊相关分析显示，脱水MAAs与抗氧化活性之间存在强正相关（r > 0.93）。这一模式与脱水MAAs的延伸共轭体系及增强的电子离域效应一致，该结构特征可能有利于自由基的稳定化。这些发现为焙烤过程中代谢物及抗氧化活性的变化提供了见解，并为优化焙烤条件提供了基础数据。
紫菜焙烤过程中代谢物谱与抗氧化活性的系统解析
一、研究背景与科学问题
紫菜（Neopyropia 和 Neoporphyra spp.）作为一种代表性红藻，因其功能性特性而日益受到关注，其消费量和产量持续增长。近年来，紫菜作为低热量健康食品的兴趣不仅在亚洲增长，在西方也在扩大。紫菜含有多种生物活性化合物，包括多糖、蛋白质、矿物质、维生素、类菌孢素氨基酸（MAAs）和多不饱和脂肪酸（PUFAs），这些化合物被报道具有降胆固醇、抗炎、抗氧化、抗癌和抗高血压等多种生理活性。
MAAs是紫菜中的一大类功能性化合物，是由中心环己烯酮或环己烯亚胺环结构与氨基酸、氨基醇或其衍生物结合而成的次级代谢物。其中，shinorine和porphyra-334被认为是紫菜中的主要化合物。MAAs主要被认为是天然存在的紫外线吸收化合物，但其结构和抗氧化活性在热处理过程中也可能发生变化。特别是，已有报道称在100°C以上的热处理可将Neopyropia yezoensis中的porphyra-334转化为脱水porphyra-334，后者表现出增强的DPPH自由基清除活性。类似地，来自Palmaria palmata的palythine和porphyra-334的热诱导脱水也增加了其ABTS+自由基清除活性。
新鲜紫菜含水量高，极易发生微生物腐败和变质，因此通常需要干燥以在长期储存中保持其品质。经热处理的干燥紫菜已被用于各种加工食品，如调味紫菜、焙烤紫菜和零食等。热处理通过诱导蛋白质变性、美拉德反应和脂质氧化等化学变化来影响食品的风味和组成，这些变化在90°C以上的温度下尤为显著。一般来说，随着焙烤温度和时间的增加，脂质氧化和热敏性生物活性化合物的降解会加速，可能改变整体化合物谱。因此，鉴定热处理引起的化合物变化对于提高加工紫菜产品的品质和功能性至关重要。
迄今为止，大多数研究集中于生鲜或干燥紫菜的近似组成、代谢物、品质因子和理化性质，而关于焙烤过程中非挥发性代谢物的变化、MAAs的行为以及抗氧化活性的研究仍然有限。特别是，尽管近年来焙烤紫菜等热处理紫菜产品的消费量稳步增长，但对其化学成分的基础研究仍不充分。Yoshiki等人（2009）证明了porphyra-334的热诱导脱水并报道了其脱水衍生物增强的DPPH自由基清除活性，但该研究主要集中于这一特定的MAA转化。相比之下，本研究旨在利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）系统地表征多种焙烤温度-时间条件下非挥发性代谢物的变化，追踪单个MAAs及其脱水衍生物，并考察焙烤诱导的代谢物变化与体外抗氧化活性之间的关联。
二、研究设计与技术方法
研究人员从韩国莞岛郡采集N. yezoensis样本（34°19′09.2″ N, 126°44′46.3″ E），经清洗、切碎、成型为20×20 cm的薄片，在70°C下干燥至最终含水量9.0±1.0%。未进一步焙烤的干燥薄片作为对照。使用商用紫菜焙烤机在不同条件下制备焙烤样品，焙烤温度设为160、180和200°C，焙烤时间分别为1、5、10、15和20秒。每个焙烤条件使用来自同一采集批次的独立紫菜薄片进行焙烤和处理。
主要技术方法包括：（1）基于UPLC-QTOF-MS的非靶向代谢组学分析，在正负离子模式下进行，用于代谢物鉴定和定量；（2）ABTS+自由基清除活性测定和铁离子还原抗氧化能力（FRAP）测定，用于评估抗氧化活性；（3）主成分分析（PCA）、方差分析-同步成分分析（ASCA）、层次聚类分析（HCA）和热图可视化等多变量统计分析方法；（4）双因素方差分析和皮尔逊相关分析用于统计验证和关联分析。
三、主要研究结果
3.1 焙烤紫菜中关键代谢物和脱水MAAs的鉴定
通过UPLC-QTOF-MS非靶向代谢组学分析，在焙烤紫菜中共鉴定出69种主要代谢物，包括11种氨基酸及其衍生物、3种有机酸、7种MAAs、11种核酸相关化合物、24种磷脂、2种糖脂、5种其他化合物和6种脱水MAAs。比较干燥未焙烤（对照）和焙烤紫菜提取物的总离子流色谱图发现，主要MAAs（包括shinorine和porphyra-334）的峰强度在对照中较高，且随焙烤温度和时间的增加而逐渐降低，同时在保留时间3.92-5.10分钟处检测到六个峰强度增加的峰。
在对照样品中也检测到脱水MAAs的峰，表明干燥过程中的热暴露可能促成了它们的形成。这些随焙烤温度和时间增加而增加的化合物被初步鉴定为脱水shinorine、脱水palythine、脱水asterina-330、脱水aplysiapalythine B、脱水porphyra-334和脱水mycosporine-glycine-alanine。其中，脱水porphyra-334经分离纯化并通过1H NMR分析支持其结构鉴定，而其余五种脱水MAAs仅基于MS/MS数据进行初步表征。
3.2 焙烤紫菜中根据焙烤温度和时间的代谢物变化
PCA分析显示，PC1和PC2分别占总方差的70.7%和18.2%。沿PC1方向，低焙烤温度和短时间条件下制备的焙烤紫菜聚集在一起，而高温和长时间焙烤的样品形成另一组。PCA载荷图表明，六种脱水MAAs是沿PC1分离的主要贡献者。
HCA分析将焙烤紫菜样品明确分为两个主要簇：簇1包括180°C焙烤10-20秒和200°C焙烤5-20秒的样品，簇2包括160°C焙烤1-20秒、180°C焙烤1-5秒和200°C焙烤1秒的样品。在160°C下，无论焙烤时间如何，代谢物组成均无显著差异；而在180和200°C下，随焙烤时间延长差异变得更加明显。
ASCA分析表明，温度（p < 0.005）和时间（p = 0.005）均显著影响代谢物谱，而它们的交互作用不显著（p = 0.25）。温度占总方差的比例大于时间，表明温度是PCA和HCA中观察到的聚类模式的主导因素。杠杆值/SPE分析确定MAAs和脱水MAAs是焙烤相关变异的主要贡献者。
双因素方差分析确定了63种受焙烤温度、时间和/或其交互作用显著影响的代谢物（q < 0.05）。热图将这些代谢物分为两个不同的簇：簇1代谢物主要包括核酸相关化合物、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、脱水MAAs、DGMG 16:0、LPA 20:5、LPI 20:5、半乳糖基甘油、甘油磷酸胆碱和藻红胆素，其含量随焙烤温度升高和时间延长而增加；簇2代谢物包括溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、溶血磷脂酰甘油（LPG）、MAAs和SQMG 16:0，随焙烤温度和时间增加而减少。
3.3 焙烤紫菜中根据焙烤温度和时间的代谢物差异
氨基酸及其衍生物： 共鉴定出11种氨基酸及其衍生物。总氨基酸含量变化为对照的0.92-1.25倍，在200°C焙烤10秒时达到最高水平。焦谷氨酸（L-谷氨酸的环化衍生物）随焙烤温度和时间显著增加，在200°C焙烤20秒时达到对照的23.54倍，而谷氨酸在相同条件下显示最低水平，表明焦谷氨酸的积累至少部分源于谷氨酸的热诱导脱水和环化。天冬氨酸和瓜氨酸也随焙烤强度增加而降低，可能归因于氨基酸的Strecker降解或氨基酸与还原糖之间的美拉德反应。
核酸相关化合物： 检测到5种5′-核苷酸和6种核苷。总5′-核苷酸含量在焙烤过程中变化为0.86-1.35倍，在200°C焙烤10秒时最高。核苷总含量变化为1.03-2.65倍，在200°C下随焙烤时间延长显著增加，表明高温处理可能导致紫菜中DNA或RNA分解并转化为各种5′-核苷酸或核苷。在200°C焙烤20秒的样品中，5′-核苷酸含量降低而核苷含量同时增加，表明5′-核苷酸在高温下可能进一步热分解转化为核苷。5′-AMP、5′-CMP、5′-GMP、5′-UMP、腺苷、胞苷、鸟苷、尿苷和5′-甲基硫代腺苷均倾向于随焙烤温度升高和时间延长而增加，而5′-IMP和肌苷则随热处理强度增加而降低。
有机酸： 检测到柠檬酸、苹果酸和琥珀酸三种有机酸。总有机酸含量变化为对照的0.75-1.05倍，随焙烤强度增加而总体下降，可能归因于热处理诱导的脱羧反应。
脂质： 总LPC含量变化为0.79-1.23倍，在200°C焙烤10秒时达到最高水平。LPA 20:5和LPI 20:5分别增加1.30-2.08倍和1.32-2.47倍，表明焙烤过程中磷脂酸和磷脂酰肌醇经历了最活跃的水解反应。相比之下，LPE和LPG呈下降趋势，变化范围分别为0.84-1.02倍和0.81-0.95倍。两种糖脂中，SQMG 16:0变化为0.83-1.01倍，DGMG 16:0变化为0.83-1.40倍。
MAAs： 随着焙烤温度和时间的增加，MAAs含量降低至shinorine的0.06倍、palythine的0.14倍、asterina-330的0.28倍、porphyra-334的0.07倍、mycosporine-glycine-alanine的0.04倍、aplysiapalythine B的0.07倍和usujirene的0.07倍，在200°C时降幅最为显著。相反，焙烤过程中由MAAs生成的脱水MAAs增加至脱水shinorine的28.62倍、脱水palythine的8.40倍、脱水asterina-330的40.67倍、脱水porphyra-334的13.14倍、脱水mycosporine-glycine-alanine的62.10倍和脱水aplysiapalythine B的27.60倍。然而，在较短焙烤时间增加后，当焙烤时间在200°C达到20秒时其含量开始下降。值得注意的是，未检测到对应脱水usujirene的峰，表明usujirene可能通过其他途径进行热转化。
3.4 不同焙烤温度下焙烤紫菜的抗氧化活性
与干燥未焙烤紫菜相比，ABTS+自由基清除活性随焙烤温度和时间的增加逐渐增加1.18-4.53倍，FRAP增加1.06-4.18倍。200°C焙烤的紫菜ABTS+自由基清除活性显著高于干燥未焙烤紫菜，但200°C焙烤10-20秒的样品之间无显著差异。FRAP则随焙烤时间延长逐渐增加，与焙烤温度无关。
3.5 代谢物与抗氧化活性之间的相关性
皮尔逊相关分析显示，干燥未焙烤紫菜中存在的MAAs（shinorine、palythine、asterina-330、aplysiapalythine B、porphyra-334和mycosporine-glycine-alanine）与ABTS+自由基清除活性（r = ?0.93至?0.81）和FRAP（r = ?0.94至?0.81）呈强负相关。相反，焙烤过程中生成的六种脱水MAAs与ABTS+自由基清除活性（r = 0.93-0.98）和FRAP（r = 0.93-0.98）呈强正相关。这些对比鲜明的相关模式表明，焙烤过程中MAAs向脱水形式的转化可能与焙烤紫菜中观察到的抗氧化活性增加密切相关。然而，焙烤紫菜抗氧化活性的升高不应仅归因于脱水MAAs，其他几种代谢物（包括5′-AMP、焦谷氨酸、腺苷、藻红胆素、胞苷、鸟苷、半乳糖基甘油、5′-甲基硫代腺苷和5′-GMP）也与抗氧化活性显著相关（r > 0.70）。此外，焙烤可诱导基质组分的变性、断裂和聚合，特别是通过美拉德型反应生成具有抗氧化活性的化合物如类黑精。
四、讨论与结论
本研究表明，脱水MAAs是焙烤紫菜抗氧化能力增强的重要贡献者，但其作用应被视为焙烤诱导的更广泛化学变化网络的一部分，而非唯一因素。从应用角度来看，促进脱水MAAs形成的焙烤条件可能与改善紫菜抗氧化相关品质有关。未来需要进一步研究以阐明脱水MAAs和其他焙烤诱导化合物对整体抗氧化活性的相对贡献。
本研究通过UPLC-QTOF-MS-based代谢组学分析表征了N. yezoensis在不同焙烤温度和时间下的组成变化。共鉴定出69种主要代谢物，包括MAAs和脱水MAAs，多变量分析显示焙烤紫菜样品根据焙烤条件呈现明显的聚类。焙烤诱导了代谢物谱的显著变化，包括MAAs的减少和脱水MAAs的增加，以及氨基酸及其衍生物、有机酸、核苷酸、核苷和磷脂的更广泛变化。以ABTS+自由基清除活性和FRAP评估的抗氧化活性总体上随焙烤强度增加而增加。皮尔逊相关分析表明，焙烤诱导的代谢物变化，特别是脱水MAAs的积累，与增强的抗氧化活性相关。这些发现为焙烤过程中代谢物变化与抗氧化活性之间的关系提供了见解，并为未来控制紫菜焙烤诱导组成变化的研究提供了生化基础。
