ATP13A2-ITCH-ALIX信号通路缺陷损害腔内囊泡生物发生并增加神经元脆弱性

《Cellular Signalling》：Defective ATP13A2–ITCH–ALIX signaling impairs intraluminal vesicle biogenesis and increases neuronal vulnerability

　　

摘要

ATP13A2是一种溶酶体P5B型ATP酶，其功能缺失突变与一系列神经退行性疾病相关，包括早发性帕金森病、Kufor-Rakeb综合征、神经元蜡样脂褐质沉积症、遗传性痉挛性截瘫以及肌萎缩侧索硬化症。尽管已知ATP13A2参与溶酶体稳态并因此与神经元退行性变有关，但新兴证据表明，它也可能影响外泌体生物学。然而，内源性ATP13A2调控外泌体发生的机制以及这一过程与神经元脆弱性的关系仍不清楚。

在本研究中，我们利用多种ATP13A2缺陷的人类细胞模型证明，ATP13A2缺陷损害管腔内囊泡（ILV）的发生，并在多种细胞背景下减少外泌体的分泌。ATP13A2的缺失并未显著影响内吞作用、早期内体丰度或多囊泡体形成，但它持续减少了多囊泡体内的ILV密度。

从机制上讲，ATP13A2缺陷促进了E3泛素连接酶ITCH在溶酶体上的蓄积，后者增强了ALG-2相互作用蛋白X（ALIX）的泛素-蛋白酶体依赖性降解，而ALIX是介导ILV膜重塑的运输所需内体分选复合物（ESCRT）的关键接头蛋白。恢复ALIX表达或降低ITCH E3泛素蛋白连接酶（ITCH）活性可挽救ATP13A2缺陷神经元中的ILV发生缺陷。此外，ATP13A2-ITCH-ALIX通路的失调增加了神经元对线粒体应激的易感性，而恢复ALIX或降低ITCH活性则显著改善了神经元存活。

综上所述，这些结果鉴定了一条ATP13A2-ITCH-ALIX信号轴，将溶酶体功能障碍与受损的ILV发生和外泌体调控联系起来。本研究提示，ILV发生的缺陷有助于神经元脆弱性的增加，而调节ATP13A2-ITCH-ALIX通路可能代表一种针对ATP13A2相关神经退行性变的治疗策略。

引言

ATP13A2是一种溶酶体P5B型ATP酶，其功能为多胺和H?/K?转运体[1]、[2]、[3]。ATP13A2的功能缺失突变最初在Kufor-Rakeb综合征（KRS，一种青少年发病的帕金森病）中被鉴定，此后与广泛谱系的神经退行性疾病相关，包括神经元蜡样脂褐质沉积症12型、遗传性痉挛性截瘫78型以及肌萎缩侧索硬化症[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。在散发性帕金森病（PD）和路易体痴呆患者中，ATP13A2表达降低与神经元丢失增加相关[10]，而存活的多巴胺能神经元则显示ATP13A2表达升高，提示可能存在代偿性或神经保护性反应[11]。综合这些临床和病理学观察，表明ATP13A2在维持神经元稳态中发挥关键作用。

与其溶酶体定位一致，ATP13A2在溶酶体稳态中具有基本作用。ATP13A2缺陷导致各种溶酶体异常，包括酸化受损、膜通透性增加、酶成熟缺陷以及自噬流紊乱，所有这些都损害神经元存活[12]、[13]、[14]、[15]。作为溶酶体多胺转运体，ATP13A2还调节溶酶体-胞质多胺平衡，从而影响细胞在应激条件下的存活[16]。此外，ATP13A2参与溶酶体-自噬体融合和Zn2?稳态[17]。越来越多的证据表明，ATP13A2缺陷细胞对线粒体和氧化应激更为脆弱，这可能是由于溶酶体功能受损、自噬清除缺陷以及涉及磷脂酰肌醇3,5-二磷酸和磷脂酸的脂质相互作用改变所致[18]、[19]。由于线粒体功能障碍和氧化应激是许多神经退行性疾病（包括PD）的核心病理特征，神经元对这些应激因子的易感性增加可能实质性地促成ATP13A2相关神经退行性变[20]、[21]、[22]。然而，将ATP13A2功能障碍与应激条件下神经元脆弱性联系起来的分子通路仍不清楚。

溶酶体和外泌体通过内溶酶体系统紧密相连，特别是通过多囊泡体（MVB）。MVB是含有管腔内囊泡（ILV）的晚期内体区室，ILV由内体膜向内出芽形成。MVB有两种主要命运：与溶酶体融合以降解ILV货物，或与质膜融合以将ILV作为外泌体释放到细胞外空间[23]。先前的研究表明，过表达的ATP13A2定位于MVB上，且携带ATP13A2突变的KRS患者来源的成纤维细胞表现出畸形的MVB，表明ATP13A2可能在调节外泌体发生中发挥作用。支持这一可能性的，Tsunemi等人证明ATP13A2过表达（OE）增强了H4神经胶质瘤细胞的外泌体分泌，而Kong等人证明ATP13A2在HEK293细胞中的过表达增加了外泌体组分中α-突触核蛋白的释放[24]、[25]。这些研究共同表明ATP13A2与外泌体发生之间的联系。

然而，几个重要问题仍未解决。先前的研究大多依赖于瞬时ATP13A2-OE系统或仅关注细胞外囊泡（EV）输出，而未定义调节外泌体发生的潜在分子机制。因此，尚不清楚内源性ATP13A2是否调控外泌体分泌、哪些下游通路介导这一过程，以及这一过程的失调如何影响应激条件下的神经元脆弱性。

在本研究中，我们利用多种人类细胞模型，研究了内源性ATP13A2在外泌体分泌和ILV发生中的作用。我们证明，ATP13A2缺陷在多种人类细胞类型中损害ILV发生。在机制上，我们鉴定了一条此前未报道的ATP13A2-ITCH-ALIX信号轴，通过ITCH介导的ALIX不稳定化将溶酶体功能障碍与受损的ILV发生联系起来。此外，我们显示这一通路的失调促成了应激条件下神经元脆弱性的增加。

章节摘要

质粒和慢病毒颗粒

质粒pcDNA3.1-ALIX-3×FLAG、pcDNA3.1-ITCH-3×FLAG和pcDNA3.1-ITCH-3×Myc购自广州IGE生物技术有限公司。质粒pcDNA3.1-HA-Ub由中南大学（CSU）张教授慷慨提供。

表达靶向ATP13A2（ATP13A2 shRNA）或非靶向对照（NC shRNA）的shRNA的慢病毒颗粒购自上海OBIo Technology。shRNA构建体在psLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE载体中生成。正向引物

ATP13A2缺陷减少EV分泌并损害ILV发生

为了研究内源性ATP13A2是否参与EV分泌，我们首先检测了ATP13A2-KO HEK293细胞中的EV产生情况（补充图1A）。EV通过差速超速离心从CCM中按照标准方案分离[35]（补充图1B）。分离的EV质量通过超微结构TEM确认（补充图1C），其颗粒浓度和大小分布通过NTA定量。与对照（Ctrl）相比

讨论

在本研究中，我们鉴定了一条ATP13A2-ITCH-ALIX信号轴，该信号轴参与ILV发生并与神经元脆弱性相关（图7）。利用多种ATP13A2缺陷人类细胞模型，我们证明ATP13A2缺陷减少了EV分泌并损害ILV形成。在机制上，ATP13A2缺陷增加了E3泛素连接酶ITCH的蛋白稳定性和丰度，后者促进了ALIX的K48连接多泛素化和蛋白酶体降解，而ALIX是一个关键的

CRediT作者贡献声明

罗琳：撰写-审阅与编辑、撰写-初稿、可视化、验证、监督、软件、项目管理、方法学、调查、形式化分析、数据整理、概念化。陈文：验证、调查。罗诗诗：验证、调查。马素珍：调查。刘凯月：调查。龚倩：调查。黄碧容：调查。陈志明：撰写-审阅与编辑、方法学。何耀辉：验证。王丹玲：撰写

资金

本研究得到了中国湖南省科技创新计划的支持（项目编号：2021SK1014）。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、手稿撰写以及发表结果的决策中均未发挥作用。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的利益冲突。

致谢

我们感谢中南大学（CSU）张卓华教授提供细胞系。

罗琳|陈文|罗诗诗|马素珍|刘凯月|龚倩|黄碧容|陈志明|何耀辉|王丹玲

南华大学衡阳医学院，湖南衡阳