《ACS Materials Letters》：Phosphatidylserine-Engineered Lipid Nanoparticles Enable Systemic mRNA Delivery to the Central Nervous System
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静脉注射的脂质纳米颗粒（LNPs）主要蓄积于肝脏，这限制了mRNA向肝外组织（尤其是中枢神经系统（CNS））的递送效率。本研究报道了一种无配体策略，利用磷脂酰丝氨酸（PS，1 mol %）工程化LNPs实现全身性CNS递送，其中胆固醇被原人参二醇（PPD）或
静脉注射的脂质纳米颗粒（LNPs）主要蓄积于肝脏，这限制了mRNA向肝外组织（尤其是中枢神经系统（CNS））的递送效率。本研究报道了一种无配体策略，利用磷脂酰丝氨酸（PS，1 mol %）工程化LNPs实现全身性CNS递送，其中胆固醇被原人参二醇（PPD）或人参皂苷Rg2替代。在静脉注射萤光素酶mRNA后，体内及离体生物发光成像显示，含PS的LNPs在脑和脊髓中均产生了强烈的蛋白表达，而不含PS的制剂在CNS相关区域的表达极低。将PS含量从1 mol %增加至4 mol %，可降低脑部表达并增强脾脏蓄积，揭示了PS对LNP生物分布的剂量依赖性调控作用。上述发现确立了低比例PS掺入作为一种可调控的策略，用于实现全身性mRNA向CNS的递送，并为CNS靶向核酸治疗提供了一个潜在的平台。
### 论文解读文章
**一、研究背景与拟解决的科学问题**
脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）已成为核酸治疗领域领先的非病毒递送平台，这得益于其高包封效率、良好的安全性及临床上的显著成功。然而，静脉注射的LNPs会通过内源性载脂蛋白介导的途径被肝脏大量截留，严重限制了mRNA向肝外组织的递送。尤其在中枢神经系统（Central Nervous System, CNS），血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）和血脊髓屏障（Blood-Spinal Cord Barrier, BSCB）有效限制了循环大分子疗法的转运，使得全身性CNS递送极具挑战。因此，开发能够在全身给药后高效递送mRNA至CNS的LNPs，成为下一代核酸治疗的主要目标。目前的策略主要依赖抗体、肽等靶向配体修饰以促进受体介导的跨细胞转运，但配体修饰会增加制剂复杂性、制造成本和批次间差异，带来规模化生产的挑战，因此亟需开发不依赖靶向配体的无配体策略。
**二、研究内容与核心结论**
研究人员基于前期开发的以原人参二醇（Protopanaxadiol, PPD）或人参皂苷Rg2替代胆固醇的无胆固醇LNP平台，创新性地引入了低比例（1 mol %）的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS），构建了PS-PPD-LNPs和PS-Rg2-LNPs两种新型递送系统。研究人员系统评估了该系统的理化性质、体外mRNA递送效率及静脉注射后的体内生物分布。研究结果显示，低水平PS掺入能够保留PS的膜识别特性，同时减少网状内皮系统截留，从而引导LNPs向CNS组织（包括脑和脊髓）分布。这项研究首次证实了低比例PS工程化LNPs可实现高效的全身性CNS mRNA递送，为无配体CNS靶向核酸治疗提供了全新平台。同时，研究揭示了PS含量是决定LNP生物分布的关键因素，确立了低比例PS掺入作为调控器官趋向性的有效策略。
**三、主要关键技术方法**
该研究涉及以下几项关键技术方法：
1. **微流控自组装技术**：利用精确的微流控装置制备PS-PPD-LNPs和PS-Rg2-LNPs，实现粒径均一、可重复的纳米颗粒合成。
2. **表征技术**：采用透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）表征形貌、粒径与多分散性；利用纳米颗粒追踪分析（NTA）验证粒径；通过琼脂糖凝胶电泳和RiboGreen定量分析评估mRNA包封率及核酸酶保护效果。
3. **体外细胞实验**：使用CCK-8法检测LNP在CNS相关细胞系（U87MG和SH-SY5Y）中的生物相容性；通过荧光显微镜和流式细胞术评估EGFP mRNA递送与表达效率。
4. **小动物活体成像（IVIS）系统**：在裸鼠（n=3，mRNA剂量=10 μg）上进行体内与离体生物发光成像，动态监测和定量分析萤光素酶 mRNA在脑、脊髓及主要器官中的表达与分布。
**四、研究结果**
1. **PS-LNPs理化性质表征与生物相容性**
TEM显示PS-PPD-LNPs和PS-Rg2-LNPs均形成形态均匀的球形纳米颗粒。DLS测定PS-PPD-LNPs平均水合粒径为108.4 ± 1.18 nm（PDI=0.16 ± 0.01），PS-Rg2-LNPs为131.1 ± 0.88 nm（PDI=0.20 ± 0.01），表明粒径分布窄、胶体均一性好。CCK-8结果显示在2–6 μg浓度下处理24 h和48 h后，两株CNS细胞系存活率均保持在80%以上，表明生物相容性良好。凝胶电泳与RiboGreen检测证实两种制剂均高效包封mRNA（包封率分别约81.6%和84.0%）并能有效抵御RNase降解。
2. **PS增强CNS相关细胞系的体外mRNA递送效率**
荧光显微镜和流式细胞术分析表明，经PS-PPD-LNPs和PS-Rg2-LNPs处理后，U87MG和SH-SY5Y细胞的EGFP绿色荧光强度相比无PS对照组显著增强，EGFP阳性细胞比例均超过95%。表明PS掺入可通过增强细胞摄取来显著提高LNP的体外mRNA递送效率。
3. **低比例PS（1 mol %）实现脑部高效mRNA递送**
体内活体成像显示，注射luc mRNA-PS-LNPs的小鼠颅骨区域发光信号显著强于无PS对照组。定量分析证实PS工程化LNPs在整个6 h内实现了极高的颅骨区域发光强度，而无PS制剂仅显示基线或可忽略的信号。离体脑组织成像在PS-LNP处理组中检测到强萤光素酶表达，直接证明mRNA在脑组织中成功翻译。
4. **脊髓组织的mRNA递送验证**
全身体成像追踪显示，注射PS-LNPs的小鼠在3 h时即可在脊髓区域检测到萤光素酶信号，6 h达到峰值。离体脊髓成像和定量分析进一步确认，PS-PPD-LNPs和PS-Rg2-LNPs处理组脊髓中萤光素酶表达显著高于无PS对照组（p < 0.01）。定量生物分布显示，PS-LNPs组的脊髓表达量分别比肾脏高约271%和200.4%，表明mRNA有效到达并功能翻译于CNS相关组织。
5. **PS含量调控LNP生物分布**
比较不同PS含量（1 mol % vs 4 mol %）的PPD-LNP制剂发现，1 mol % PS-PPD-LNP在脑组织产生的萤光素酶表达是4 mol %制剂的约1.45倍；而4 mol %制剂在脾脏的表达是1 mol %制剂的约1.9倍。这表明PS作为“吃我”信号，过高比例会增强吞噬细胞识别，将NPs引导至脾脏等网状内皮器官，揭示了高效脑递送存在一个最优PS含量窗口。
**五、讨论总结与研究结论**
讨论部分指出，PS-PPD-LNP组脑部萤光素酶表达高于PS-Rg2-LNP组，可能归因于PPD本身的血脑屏障穿透能力及其与脑型肌酸激酶（CK-BB）的特异性亲和力，提示PPD的掺入可能通过PPD介导的脑部可及性与PS介导的细胞摄取机制协同作用，进一步增强CNS递送能力。此外，PS含量依赖性分布行为与PS作为“eat-me”信号的生物学功能密切相关，过高的PS比例不利于脑部递送。
**研究结论**：研究人员开发了一种无配体、PS工程化的LNP平台（PS-PPD-LNPs和PS-Rg2-LNPs），用于静脉给药后全身性mRNA向CNS的递送。低水平PS（1 mol %）的掺入使LNP分布指向CNS组织，在脑和脊髓中实现强劲的mRNA递送和功能性蛋白表达，而将PS含量从1 mol %提高到4 mol %则使分布转向脾脏。该研究建立了一种简单、无配体的全身性CNS mRNA递送策略，并凸显了PS工程化作为调控纳米颗粒生物分布以开发CNS靶向核酸疗法的有效途径。
