双氯芬酸在大型溞中的情境依赖性毒性：水质化学、幼体来源及制备程序的作用

《Aquatic Toxicology》：Context-Dependent Toxicity of Diclofenac in Daphnia magna: Roles of Water Chemistry, Neonate Source and Preparation Procedure

　　

摘要

大型溞（Daphnia magna）是药物生态毒理学研究中公认的标准参考生物。标准化的急性毒性测试方案规定了测试介质的组成，任何替代水类型都必须经过充分表征并予以报告。在大型溞的急性毒性测试中，通常使用幼体作为测试生物。尽管方法学框架严格，但已报道的大型溞对双氯芬酸（DCF）的EC₅₀值差异较大，范围从22.4至123.3 mg L^-1，其中测试用水是最少被报告的因素。因此，在本研究中，我们调查了暴露介质（M4培养基和受测天然淡水）以及大型溞幼体的来源和制备程序对DCF毒性的影响。结果表明，DCF对大型溞的毒性在受测天然淡水和M4培养基之间可能存在差异，在受测天然淡水中观察到较高的EC₅₀值。此外，在不同幼体组之间也观察到敏感性差异。这些发现强调了解释和比较基于溞的生态毒理学数据时考虑测试生物来源和制备历史以及暴露介质的重要性。总体而言，这些发现为该新兴污染物对模式参考物种的毒理学效应提供了额外见解，所研究条件比标准实验室方案所规定的条件更接近受测天然淡水的环境。

引言

双氯芬酸（DCF）是一种非甾体抗炎药（NSAID），由于其常规废水处理系统去除效率低（大多数情况下低于50%）（Alessandretti et al., 2021; Ko?ecka et al., 2020, 2022），以及其存在于排入天然水体（浓度范围为0.1至5.0 mg L^-1）的废水中（Bethke et al., 2024; Cherik et al., 2015; Elshikh et al., 2022; Zhang et al., 2008），而在水环境中被广泛检测到。因此，DCF在表面水中持续存在（据报道欧洲表面水中浓度超过50 ng L^-1）（Di Lorenzo et al., 2021），并可能影响非靶标生物，其中兀鹫（Gyps）的灾难性死亡是其生态影响的极端案例（Oaks et al., 2004）。该化合物已被列入欧盟观察清单，并被归类为新兴污染物（Helcom, 2018）。在标准化实验室条件下，其对标准测试生物的急性毒性和慢性毒性已被广泛研究（Leverett et al., 2021; Sathishkumar et al., 2020）。此类由国际组织制定的生态毒性方案旨在通过控制水质组成、pH、温度、光周期和测试时长等因素来最小化实验变异。这种标准化促进了研究间的可比性，并支持识别敏感物种和有害物质。然而，天然水体中的环境条件往往与实验室条件明显不同（Fischer et al., 2013）。因此，在标准化条件下获得的毒性估计可能无法完全反映在不同环境条件下观察到的反应（Franco, 2025）。此外，新兴证据表明，水质酸化和温度升高等环境胁迫可能改变药物毒性（Bethke et al., 2023）。因此，预测化学物质对生态系统的影响需要更接近自然环境条件下的毒性研究（Schneeweiss et al., 2023）。将实验室对单一化合物的观察外推至具有多种胁迫因子相互作用的复杂食物网的真实生态系统仍是一项重大挑战（Nilsen et al., 2019）。因此，将多胁迫因子方法整合到生态毒理学研究中变得越来越重要（Gessner and Tiliu, 2016）。因此，当前的生态毒理学研究正日益向更具生态相关性的实验和更好地外推至环境响应的数据生成方向发展（Franco, 2025）。

溞属（Daphnia）物种是分布广泛的浮游动物，栖息于pH和温度变化范围广泛的环境中，包括理化条件既有季节性又有昼夜波动的小池塘。由于其生态相关性和明确的生物学特征，它们在生态毒理学中被广泛用作模式生物（Tkaczyk et al., 2021）。事实上，溞类的生态和生物学已被广泛研究了250多年（Ebert, 2005）。在Parolini（2020）提供的关于NSAIDs对水生无脊椎动物毒性的综合综述中，基于EC₅₀（半数最大有效浓度）值，DCF被发现在大型溞中最具毒性的NSAIDs之一。药物的急性毒性通常使用实验室测试的EC₅₀值进行表征。对于大型溞，最常用的参考方案是OECD 202“溞属急性固定测试”。该方案允许使用天然水（地表水或地下水）、重构水或去氯自来水作为测试介质，前提是在培养、驯化和测试过程中溞类存活且无胁迫迹象。可接受的pH范围为6-9，允许用NaOH或HCl进行调整。还应报告测试水的理化特性。然而，评估DCF对大型溞毒性的研究综述（表S1，补充信息I，SI）表明，测试水的描述往往不完整。最常见的是仅提供对使用重构硬水的一般性引用，而未具体说明其制备配方。硬度、电导率和pH等关键参数也经常缺失。所报告的EC₅₀值差异很大（22.4-123.3 mg L?1），这表明方法学（应用不同方案）、生物学（生物来源）和理化因素（例如测试介质）可能导致大型溞急性DCF毒性的变异。

变异的一个潜在来源是测试生物的来源和制备程序。OECD指南推荐使用小于24小时的溞类幼体，并建议避免使用第一胎个体以最小化变异。幼体应来自健康的实验室培养。然而，在某些研究——特别是使用商业微生物测定法的研究——中，测试生物直接来自休眠卵（所谓无培养测试）（例如，Baran et al., 2021; Bia?k-Bielińska et al., 2022; Eluk et al., 2021）。使用休眠卵消除了维持连续培养的需要。先前的研究表明，休眠卵幼体（EE-Neo）和孤雌生殖幼体（P-Neo）在对化学物质的反应上可能存在差异（Moreira Dos Santos和Persoone, 2000）。然而，Moreira Dos Santos和Persoone（2000）报告的重铬酸钾、五氯酚钠、2,4-二氯苯氧乙酸和马拉硫磷的EC₅₀比值为0.77至1.29，表明两种幼体类型之间具有较好的吻合度。尽管如此，仅测试了四种化学物质，且所测试的化学物质中没有药物。因此，应开展关于确定药物急性毒性时测试生物来源的系统性调查。在自然条件下，两种幼体类型都存在，但在大型溞的水体出现季节的大部分时间里，P-Neo占主导地位。

在本研究中，我们调查了两个可能影响大型溞中DCF急性毒性的因素。首先，我们通过比较在表征良好的天然淡水（NF）（以增加生态相关性）和M4培养基中进行测试，研究了测试介质对DCF对大型溞毒性的影响。受测NF的理化特性在OECD 202测试用水建议范围内。其次，我们研究了幼体来源和制备程序（EE-Neo与P-Neo）是否与观察到的毒性差异相关。最后，评估了两个因素及其交互作用的影响。我们假设DCF对大型溞的毒性在受测NF和M4培养基之间以及在幼体来源和制备程序（EE-Neo与P-Neo）之间存在差异。总体目标是评估DCF对具有代表性的广泛分布浮游动物物种的毒性，所研究条件更接近受测NF的环境，并为该广泛检测到的药物的急性毒性估计的变异提供额外见解。

章节摘要

化学品

DCF钠盐（C₁₄H₁₀Cl₂NNaO₂，CAS 15307-79-6，纯度>98%，药物二级标准品）购自Merck（德国）。Bold改良基础淡水（BMBF）溶液购自Merck浓缩液。去离子水（DI，0.05 μS cm^-1）由Hydrolab（波兰）系统提供。冰醋酸和醋酸铵（均为HPLC级）购自VVR Chemicals。人工硬水（M4培养基）按照OECD 211指南使用DI水制备

天然水与M4培养基之间的主要差异

NF的温度、pH、电导率和溶解氧含量结果列于表S2（SI1）。6月记录的最高温度为24°C。水的pH范围为6.74至8.40（中位数：7.36），电导率范围为457至901 μS cm^-1（中位数：594 μS cm^-1），溶解氧范围为5.0至8.1 mg L^-1（中位数：5.8 mg L^-1）。在48小时急性测试期间，NF和M4培养基的理化特性仅发生轻微变化（表S5，SI1）。两者均

讨论

文献报道DCF对大型溞的EC₅₀值范围很宽，从22.4至123.3 mg L?1（表S1，SI1）。这表明，即使使用相似的生物和方案，生态毒性结果也可能相差一个数量级。在我们的测试组中（表3）也观察到GM EC₅₀值的相似变异，所获得值范围为34.86 mg L?1（M4培养基中的EE-Neo）至90.52 mg L?1（NF中的P-Neo）。这些结果表明，两者均

结论

结果显示DCF对大型溞的毒性在受测天然淡水和M4培养基之间以及幼体来源和制备程序（EE-Neo与P-Neo）之间存在差异。最高抗性（最高EC₅₀）在NF中测试的P-Neo中观察到（GM = 90.52 mg L^-1，GSD = 1.02），而最低抗性在M4培养基中的EE-Neo中观察到（GM = 34.86 mg L^-1，GSD = 1.15）。尽管M4和NF的理化特性已明确定义，但没有单一化学因素能完全解释

CRediT作者贡献声明

Katarzyna Bethke：数据管理、正式分析、写作 – 初稿、调查研究、概念化。Magda Caban：概念化、正式分析、调查研究、方法学、监督、写作 – 初稿、写作 – 审稿和编辑、项目管理、方法学、调查研究、资金获取

数据可用性

支持本研究结果的数据在Repozytorium.bg.ug.edu.pl上公开可用，doi 10.71853/gwxj-nh56。

未引用参考文献

Gworek et al., 2019, Jonczyk和Gilron, 2005, Kikuchi et al., 2017, Sison-Mangus et al., 2015, Ulm et al., 2000

CRediT作者贡献声明

Katarzyna Bethke：写作 – 审稿和编辑、写作 – 初稿、调查研究、正式分析、数据管理、概念化。Magda Caban：写作 – 审稿和编辑、写作 – 初稿、监督、项目管理、方法学、调查研究、资金获取、正式分析、概念化。

Katarzyna Bethke|Magda Caban

格但斯克大学，环境分析系，化学学院，Wita Stwosza 63, 80-308 格但斯克，波兰