6PPDQ及其羟基代谢物在鱼类细胞系和大西洋鲑鱼中的毒性评估

《Aquatic Toxicology》：Toxicity Assessment of 6PPDQ and Its Hydroxy Metabolites in Fish Cell Lines and Coho Salmon

　　

摘要

N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-p-苯二胺醌(6PPDQ)是轮胎防老化剂6PPD的转化产物,已被证实与敏感鲑鱼种的急性死亡相关。尽管羟基化通常被视为结合前的初步解毒步骤,但特定羟基化代谢产物的毒性仍未被充分理解。本研究使用三种鲑鱼来源的细胞系(银鲑CSE 119、虹鳟RTG 2和奇努克鲑CHSE 214)评估了6PPDQ、醌环羟基化的6PPDQ-1-OH和苯环羟基化的p-羟基-6PPDQ的细胞毒性,并辅以幼龄银鲑体内的急性毒性试验来补充这些数据。在体外实验中,6PPDQ在银鲑细胞中表现出最高毒性,在虹鳟细胞中表现出中等毒性,在奇努克鲑细胞中无可检测效应。6PPDQ-1-OH在所有细胞系中表现出明显降低的细胞毒性。相比之下,p-羟基-6PPDQ在所有细胞系中的效力均强于母体醌,且在不同物种间的敏感性存在显著差异。在体内实验中,6PPDQ-1-OH在名义浓度1000 ng/L下未显示致死作用,而p-羟基-6PPDQ在银鲑中诱导急性致死,24小时LC??为113 ng/L。这些结果表明羟基化并非普遍具有解毒作用,羟基化的位置对毒性有重要影响。我们的发现强调了代谢产物特异性评估对于理解轮胎磨损颗粒物衍生化学物质毒性效应的重要性。

引言

N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-p-苯二胺-醌(6PPDQ)是轮胎防老化剂6PPD的氧化产物,会导致敏感鲑鱼(尤其是银鲑Oncorhynchus kisutch)急性死亡。近期的一篇综述总结了6PPDQ在水生环境中的存在、分析方法及生态毒理学效应,并强调了对其生态影响的日益增长的关注(Wang等,2025)。除了其在鲑鱼中毒性已被广泛记录外,6PPDQ对其他水生生物的不利影响也有报道,包括秀丽隐杆线虫的跨代神经毒性和暴露于环境相关浓度的两栖动物肝脏脂质代谢紊乱(Tan等,2025;Liu等,2024),表明6PPDQ的生态影响可能超出鱼类范畴。虽然其环境存在、生物富集和生物体水平效应日益被记录,但控制解毒的代谢过程仍未完全阐明。近期工作(2023-2025)强调了一相羟基化作为初始阶段的关键步骤,生成6PPDQ-1-OH(醌环)和p-羟基-6PPDQ(苯环),随后经二相葡萄糖醛酸化消除(Grasse,2023;Montgomery,2023;Woytowich,2025)。在机制上,细胞色素P450——特别是CYP1A——是这些转化的核心。抑制研究(α-萘氟唑、槲皮素、氟西汀)和虹鳟肝微粒体的体外测定已证实CYP依赖性羟基化,包括区域选择性C4侧链羟基化(Nair,2025a)。C4-OH-6PPDQ对银鲑胚胎细胞无细胞毒性,但母体化合物和C3-OH异构体保留毒性,表明特定羟基化反应可减弱固有毒性。Nair(2025c)显示缺乏类似代谢途径的密切相关PPD-醌在体外不能重现毒性反应,从而将代谢选择性和酶活性与种间敏感性联系起来。跨物种比较分析强化了这种代谢观点。Montgomery(2023)报道在所有受试鱼类中均检测到O-葡萄糖醛酸结合物,但在耐受性类群(如白鲟、奇努克鲑)中浓度显著更高,这与增强的CYP/UGT能力一致,也与通过羟基化后接结合的序列作为毒理学结果决定因素相符合。空间分辨代谢组学成像与快速生物转化和胆汁消除相一致:Woytowich(2025)使用纳米DESI MSI技术显示,虹鳟稚鱼中羟基化产物主要定位于肝脏和肠道,而母体化合物6PPDQ的检测极少。种间敏感性差异在体外得以重现。Greer等(2023)使用多种鲑鱼来源细胞系建立了体外毒性模型,并表明细胞对6PPDQ的敏感性在物种间存在差异。补充生物转化研究,Xie(2024)显示对6PPD和IPPD进行臭氧化会快速生成含6PPDQ-1-OH和p-羟基-6PPDQ的毒性混合物,在虹鳟稚鱼中诱导急性死亡,并对银鲑细胞产生细胞毒性;相比之下,结构不同的PPD(DPPD、CPPD)表现出极低的反应性且无毒性。这些发现强调分子结构支配环境转化和毒性,突出羟基化作为关键解毒步骤的重要性,并表明某些羟基化物种在特定条件下可保留生物活性。尽管Nair(2025b)近期通过研究芳基-OH-6PPD-Q异构体在银鲑胚胎细胞系(CSE-119)中的区域选择性体外毒性提供了重要初步见解,但关于苯环羟基化6PPD-Q代谢产物的毒性和这些代谢产物的种间敏感性差异的信息仍然有限。本研究旨在评估羟基化6PPD-Q代谢产物在多种鲑鱼来源细胞系中的毒性,包括虹鳟和奇努克鲑。这些体外评估辅以银鲑体内的急性毒性试验。这种整合方法允许更全面地评估特定羟基化途径对毒性以及鲑鱼中物种特异性敏感性的影响。

章节片段

化学物质与样品溶液制备

除非另有说明,所有用于细胞毒性实验的化学物质均购自富士胶片和光纯化学品株式会社(日本大阪)。测试化合物6PPDQ(纯度:≥95%)、6PPDQ-1-OH(纯度:≥95%)和p-羟基-6PPDQ(纯度:≥98%)购自凯曼化学公司(美国密歇根州安娜堡)。测试化学品以1 mg/mL浓度溶解于二甲基亚砜(DMSO)中。

细胞培养

使用了来自三个鲑鱼物种的鱼细胞系,包括CSE-119(ECACC 95122019;银鲑,O.)

三种PPDQ的细胞存活率测定

使用蓝藻红醛(Alamar Blue)测定法评估了6PPD-Q、6PPDQ-1-OH和p-羟基-6PPDQ对三种鲑鱼来源细胞系(CSE-119、RTG-2和CHSE-214,图1,表S7和S8)细胞存活率的影响。6PPD-Q暴露导致CSE-119细胞产生显著细胞毒性,EC??为12.3 μg/L,其次是RTG-2细胞,EC??为49.5 μg/L。相比之下,即使在最高测试浓度500 μg/L下,CHSE-214细胞也没有显示可测量的存活率下降。对于

讨论

我们的体外数据表明,细胞系对6PPDQ、6PPDQ-1-OH和p-羟基-6PPDQ表现出明显的特异性敏感性。与既往强调早期一相羟基化和随后的结合作为鱼类中6PPDQ关键解毒途径的报道一致(Grasse,2023;Montgomery等,2023;Woytowich等,2025;Nair等,2025a),6PPDQ-1-OH表现出相对较低的细胞毒性(EC??仅在CSE-119中为336 μg/L)。重要的是,先前工作已证明相同的细胞系(CSE-119,

作者贡献

所有作者均对研究构思和设计作出贡献。材料准备、数据收集和分析由森山明弘、 Mano宏幸、原纯子和太礼完成。稿件初稿由森山明弘和Mano宏幸撰写,所有作者均对稿件的所有版本进行评论。所有作者阅读并批准了最终稿件。

符合伦理标准

实验按照国家和国际关于动物照护和使用的法规/指南进行。

作者贡献

A.

CRediT作者贡献声明

森山明弘: 写作——审阅与编辑,写作——初稿,可视化,验证,形式分析,数据整理,构思。 Mano宏幸: 写作——审阅与编辑,写作——初稿,可视化,验证,形式分析,数据整理,构思。 原纯子: 写作——审阅与编辑,形式分析,数据整理,构思。 太礼: 写作——审阅与编辑,形式分析,数据整理,构思。 内藤渉: 写作——Akihiro Moriyama|Hiroyuki Mano|Junko Hara|Rie Tai|Wataru Naito日本国立产业技术综合研究所(AIST),安全与可持续性科学研究院,茨城县筑波市大野木16-1,邮编305-8569