基于斑马鱼的金属毒性比较图谱鉴定钒为多靶点神经行为毒性物质并揭示有效的螯合保护

《Aquatic Toxicology》：A Comparative Zebrafish Atlas of Metallic Toxicity Identifies Vanadium as a Multi-Target Neurobehavioral Toxicant and Reveals Effective Chelation Protection

　　

**摘要**

金属元素的环境污染正对神经行为健康构成新兴威胁。本研究并未将各金属元素逐一独立评估，而是在成年斑马鱼中建立了一套标准化高通量行为表型组学平台，将三维运动追踪与镜像咬噬（攻击行为）及捕食者回避（恐惧反应）试验整合于相同的暴露条件下，从而实现对37种金属元素进行系统性行为毒性鉴定和直接的跨金属优先级排序。多变量行为指纹图谱分析显示，重金属类元素所诱导的表型变异性和严重程度均高于稀土元素，其中钒被确定为关联严重神经行为紊乱的最高优先级候选物质，其效应呈现浓度依赖性递进模式：从焦虑样行为到运动抑制、行为脱离乃至死亡。钒暴露鱼类的脑部RNA测序分析揭示，适应性免疫信号通路受到协同抑制，同时甾醇代谢和碳水化合物代谢发生重编程，表明观察到的行为紊乱伴随广泛的脑部相关分子扰动。为缓解该毒性，我们评估了四种天然螯合剂（壳聚糖、柠檬酸、海藻酸钠、单宁酸）与钒共同孵育于暴露水中的效果。柠檬酸提供了最强的行为与生存保护，且脑部转录组分析表明，共同孵育可保护鱼类免受钒单独暴露所引起的线粒体损伤和凋亡启动。然而，该保护作用具有暴露阶段选择性：与暴露后转移的比较表明，柠檬酸主要在共暴露期间发挥保护效应，而非有效逆转已建立的毒性。综上，这些发现建立了一个可扩展的行为毒性筛查平台和一个金属元素比较图谱，同时证明水体螯合是一种有前景的预防性但非治疗性策略，可用于缓解水生环境中的钒毒性。

**引言**

由于金属元素具有持久性、生物累积性以及往往不易被察觉的生态影响（Wu等，2024），全球环境中金属元素的污染已成为重大关切。铅、镉、钒、铬和镍等元素主要来源于采矿、工业排放、农业径流和城市化进程（Wang等，2025）。一旦释放，这些元素将在沉积物和水体中持久存留，并在生物体内不断积累（Hama Aziz等，2023）。同样，稀土元素（REEs）因广泛应用于电子和可再生能源技术领域（Deng等，2021），已成为新兴的水生污染物，有研究报告显示其在大型藻类和水生动物中的累积水平极高（Jeric等，2025）。与可降解的有机污染物不同，金属类毒素通常在水生环境中持久存留并累积（Santhosh等，2024）。其归宿和毒性会随金属形态、水质化学和生态系统条件的变化而改变（Banaee等，2025）。慢性暴露可破坏水生生态系统、降低生物多样性，并威胁依赖受污染水资源的较高营养级生物，包括人类（Santhosh等，2024）。这些持久性和累积性效应凸显了在用水环境中亟需有效监测和缓解策略的紧迫性。

新兴金属污染物威胁着水生生态系统与人类健康，凸显了快速环境评估的需求。镉、铅和铬等金属可通过氧化应激和离子失衡干扰水生生物，降低生物多样性（Hama Aziz等，2023）。尽管研究较少，稀土元素可在水生生物体内累积，干扰发育、生存和生态系统过程，可能损害生态系统健康（Markich等，2024）。人类通过受污染的水体和食物链暴露于这些金属，导致器官毒性、神经系统损伤和长期健康风险（Jaishankar等，2014；Jomova等，2025）。值得注意的是，某些重金属与神经退行性疾病有关，如阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症，这些疾病涉及神经元退化、蛋白质错误折叠、淀粉样斑块蓄积和线粒体功能障碍（Nabi和Tabassum，2022；Sheikh等，2013）。由于金属具有持久性、生物累积性并以复杂混合物形式存在，早期检测和有效监测对于保护生态系统和人类健康至关重要（Cannon和Greenamyre，2011）。

动物模型被广泛应用于毒理学研究，但利用斑马鱼结合敏感的功能指标评估金属毒性方面的应用仍较为有限。由于斑马鱼（*Danio rerio*）对污染物高度敏感（di Domenico等，2024），它们越来越多地被认可为研究新兴金属类毒素的有效水生"生物传感器"（Lin等，2022）。斑马鱼与较高级脊椎动物在遗传和神经生理方面的保守性，使其既能提供转化医学的洞察，又能保持实验的可扩展性。综上，斑马鱼兼具脊椎动物水平的神经生物学相关性和实验的可扩展性，并可提供可量化的行为学输出，是评估毒物诱导的行为和分子紊乱的强有力模型系统。行为学改变是毒物暴露的敏感指标，但不能仅凭此判断直接神经毒性，因为全身性生理紊乱也可能影响行为（Sloman和McNeil，2012）。因此，行为表型组学可作为功能性筛选和优先级排序手段，后续分子分析则可为优先表型潜在机制提供进一步见解。以往研究表明，金属暴露可干扰斑马鱼行为并诱发多器官毒性，凸显了其对金属类毒素的敏感性（Majid等，2025）。尽管具有上述优势，许多金属元素的神经行为效应仍缺乏充分表征，尤其在成年斑马鱼中。大多数研究聚焦于单一金属和早期生命阶段，对研究较少金属的成年神经行为效应了解不足。此外，水生生物暴露于多种金属污染物，但在标准化实验条件下系统比较其神经行为效应的研究仍然有限（Kocag?z等，2025）。这些空白凸显了需要全面且标准化的方法，以系统鉴定不同金属类毒素并识别与显著神经行为紊乱相关的化合物。

在通过比较行为学鉴定和排序金属类毒素之后，下游干预策略可为行为表型组学框架提供另一应用方向。天然且生物相容的金属结合剂因其降低金属生物利用度和毒性方面的潜力而受到关注。壳聚糖是一种阳离子生物聚合物，可通过氨基和羟基与二价及三价金属离子配位，广泛用于重金属吸附（Crini和Lichtfouse，2019）。柠檬酸等有机酸可形成稳定的金属-配体复合物，降低游离离子物种的可用性和生物反应性（Wang，2010；Yin等，2024）。类似地，海藻酸钠通过羧酸介导的结合与金属离子相互作用（Lee和Mooney，2012），而单宁酸含有多个酚羟基，能够螯合过渡金属并可能限制其氧化反应性和吸收（Hosseini等，2025）。尽管这些物质的金属结合和解毒能力已被广泛研究，但它们减轻活体生物中金属诱导的神经行为学和分子改变的能力仍需进一步探索。特别是它们对行为表型、氧化应激反应和转录调控的保护作用，仍在水生脊椎动物系统中亟需深入研究。因此，本研究中将干预测试作为行为优先级排序确定高度致害金属类毒素后的下游应用纳入。该方法将行为表型组学工作流程从毒物鉴定延伸至优先神经行为表型缓解评估（图1）。

超越单一金属评估，本研究建立了一个整合行为表型组学平台，用于在成年斑马鱼中筛选和优先排序37种与神经行为紊乱相关的金属污染物。该平台作为功能性筛选工具，而非独立建立神经行为毒性机制的方法。工作流程整合了标准化暴露、定制行为学记录、自动化轨迹提取、多维度终点分析和多变量表征，以系统比较不同金属污染物的神经行为反应。重要的是，该标准化框架能够确定在共同暴露挑战下哪些金属产生独特的神经行为表型，同时弥补了对许多研究较少金属元素在成年斑马鱼中神经行为效应了解不足的问题。平台的高通量能力通过整合斑马鱼行为分析管线实现，该管线包含自定义三维运动系统（Audira等，2018a）和多试验行为学塔（Audira等，2018b），配合标准化毒物暴露和实验装置可同时记录多个个体，从而减少了复杂设备的需求。标准化行为轨迹使用idtracker.ai提取（Romero-Ferrero等，2019；Torrents等，2026），随后使用基于Python的工具自动计算终点，包括用于三维运动分析的Fish 3D Locomotion App（F3LA）和用于攻击和恐惧反应行为的Tower Assay Analyzer（TAA）（Luong等，2024）。每个组件都简化了工作流程，使数据处理更快，同时最小化人工操作和依赖操作者的误差。对37种金属元素的系统表征生成了多维行为特征，使得基于总体神经行为紊乱程度进行毒物比较和优先级排序成为可能。随后选择钒进行浓度依赖性和分子特征化，并将天然金属结合剂作为下游缓解应用进行评估。总体而言，该框架提供了一种可扩展策略，用于识别被忽视的环境毒物、检测亚致死性行为紊乱，并为机制研究确定污染物优先级。

**方法片段**

**斑马鱼饲养**

野生型成年斑马鱼（4-6月龄）从经认证的 Aquarium 供应商处获得，并在实验前适应实验室条件。所有鱼类均在循环水系统中按标准化条件维持，包括14:10小时的光暗周期、控温28.5 ± 0.5°C的水温、7.2至7.5的pH值以及300至1500 μS的电导率。斑马鱼每日投喂两次——一次喂食实验室培养的卤虫，一次喂食商业干饲料。

**重金属暴露斑马鱼的三维运动分析**

在相同条件下将成年斑马鱼暴露于21种金属和类金属元素（非稀土元素）中，在14个终点上诱发了广泛的神经行为改变，揭示了独特且有时相反的表现型。在运动活性方面，铅和锂增加了快速运动时间，提示过度活动或异常窜逃，其中锂效应最强。相反，钼、镍和钒诱导了活动降低，表现为平均速度降低。钨……

**整合行为学图谱实现功能性神经行为毒性筛选与优先级排序**

本研究的主要意义在于展示了行为表型组学如何提供一个可扩展的功能性框架，用于筛选和优先排序可能具有行为毒性的金属类污染物。与传统的通常使用死亡率、形态学或孤立的行为终点来评估单个毒物的方法不同，行为表型组学整合了多个行为域，以捕获多维表型特征。这实现了系统的跨金属……

**结论**

本研究建立了一个标准化的行为表型组学框架，利用整合的三维运动、攻击行为和捕食者回避试验，在成年斑马鱼中进行跨金属毒性优先级排序。在包括运动、焦虑样行为、探索、社会互动、恐惧反应和运动协调在内的多个终点中，重金属类元素诱导的神经行为缺陷比稀土元素类更为严重。多变量分析进一步揭示……

**CRediT作者贡献声明**

- 概念化：M.-Q.T.、C.-D.H.
- 数据整理与正式分析：B.A.K.、S.-C.W.
- 资金获取：M.-D.L.、C.-D.H.
- 监督：M.-D.L.、C.-D.H.
- 初稿撰写：M.-Q.T.、M.-D.L.、C.-D.H.

**数据可用性**

RNA-seq数据已提交至NCBI BioProject，登录号为PRJNA1467752。

**意义声明**

本研究通过对37种重金属和稀土元素在相同暴露条件下，利用成年斑马鱼高通量行为表型组学平台进行表征，首次建立了脊椎动物模型中金属神经毒性的全面比较图谱。通过整合三维运动、攻击行为和恐惧试验与脑部转录组学，我们证明重金属引发的神经行为紊乱比稀土元素更为严重和异质化。钒……

**CRediT作者贡献声明**

- Minh-Quan Tran：初稿撰写、方法学、概念化
- Basit Ali Khan：方法学、资金获取
- Szu-Chieh Wang：验证、正式分析
- Ming-Der Lin：初稿撰写、监督、概念化
- Chung-Der Hsiao：初稿撰写、验证、资源、项目管理、资金获取、概念化

Minh-Quan Tran | Basit Ali Khan | Szu-Chieh Wang | Ming-Der Lin | Chung-Der Hsiao

中元大学生命科学院，台湾桃园市中坜区中北路200号，邮编320314