《Biomacromolecules》：3D-Printed Dextran/PCL Bilayer Tubes Supporting Neural Cell Viability for Peripheral Nerve Repair
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周围神经损伤常导致长期功能缺损。本研究提出了一种通过3D挤出打印制备的双层神经导管，将基于PCL的外层与含N2a细胞的右旋糖酐基内层水凝胶相结合。研究人员开发了三种PCL/PEGDA配方（35PCL2k:65PEGDA、50PCL2k:50PEGDA和40PC
周围神经损伤常导致长期功能缺损。本研究提出了一种通过3D挤出打印制备的双层神经导管，将基于PCL的外层与含N2a细胞的右旋糖酐基内层水凝胶相结合。研究人员开发了三种PCL/PEGDA配方（35PCL2k:65PEGDA、50PCL2k:50PEGDA和40PCL2k:40PEGDA:20PCL530），实现了右旋糖酐/PCL导管的可扩展制造，同时消除了二甲基亚砜（DMSO）的使用及其相关的后处理步骤。内层20Dex:5HAMA:10GelMA水凝胶通过迭代测试进行了优化。全面的理化、力学和细胞毒性分析显示，所有PCL基配方均表现出相似的行为，其中50PCL2k:50PEGDA展现出优异的机械强度和细胞相容性。正如预期，20Dex:5HAMA:10GelMA表现出较低的机械阻力和更快的降解速率，但强烈支持细胞活力和增殖。两种墨水均成功打印成双层导管，该导管在可缝合性测试中表现出高抵抗力，能够承受缝合过程而不撕裂或变形。这些结果凸显了该系统在未来的体内神经再生研究中的巨大潜力。
**研究背景与科学问题**
周围神经损伤每年影响约每10万人中的18人，常导致严重的运动和感觉功能缺损，仅有约三分之二的患者能完全恢复功能，是长期残疾的主要原因之一。周围神经损伤常见于工业事故、跌倒、穿透性创伤和交通事故。尽管自体神经再生可以发生，但对于长距离缺损而言，再生过程缓慢且不充分，导致持续性运动障碍、感觉丧失和慢性疼痛。对于超过3厘米的缺损，手术自体神经移植仍是临床金标准，因其免疫原性低且效果显著。然而，自体移植存在供区发病、感觉丧失以及神经直径或束状结构不匹配等明显缺陷。
为克服这些局限，基于生物材料的神经导管（nerve guidance conduits，NGCs）已成为有前景的合成替代方案。通过连接离断的神经残端，NGCs可引导轴突再生、提供结构支撑并免除二次手术部位。理想的NGC应模拟天然神经生理学、具备适当的机械性能、允许营养扩散、安全降解，并整合促进再生的生化和生物物理线索。然而，现有的商业化NGCs通常由壳聚糖、胶原蛋白或聚（DL-丙交酯-ε-己内酯）制成，但往往缺乏足够的机械强度，仅对小缺损（<3厘米）有效，且可能在降解过程中引发免疫反应。此外，大多数为简单的单层中空管，缺乏引导轴突生长所需的内部微结构。尽管有制造商引入了双层系统，但静电纺丝和冷冻干燥等制造方法限制了几何复杂性、可扩展性和活细胞的整合。总体而言，文献表明，由合成和天然聚合物组成的双层NGCs尚未通过基于挤出的3D打印成功制备。
**研究内容与结论**
为应对这些挑战，研究人员开发了一种新型基于挤出的3D打印策略，用于制造包含N2a神经细胞的双层NGCs。该研究选择右旋糖酐和PCL，是因为这两种聚合物均用于FDA批准的制剂和植入式设备中。右旋糖酐具有优异的生物相容性和用于功能化的反应性羟基，而PCL提供承重结构所需的机械强度。由于挤出打印不需要有机溶剂，因此消除了DMSO的使用，实现了可扩展生产并允许直接掺入促进生长的生物元件。双层设计赋予每种聚合物特定功能：PCL提供机械坚固的外层，而右旋糖酐形成适合直接细胞打印的生物相容性内层。通过用2-异氰酸乙酯甲基丙烯酸酯（IEMA）和甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）分别修饰PCL和右旋糖酐，引入了可光聚合基团。所得导管评估了其降解性和细胞相容性。将神经细胞直接嵌入导管内可提供必要的生物线索，并创造有利于轴突再生的微环境。两种墨水均成功挤出以制备双层导管，其具有高机械稳健性，可通过可缝合性和缝合张力测试证明，凸显了其在周围神经再生中的应用潜力。
**关键技术方法**
研究人员采用了以下主要关键技术方法：（1）聚合物功能化：将右旋糖酐与GMA反应生成Dex-GMA（修饰度23.3%），将PCL-diol（Mw～530和2000 g mol?1）与IEMA反应生成PCL-IEMA（修饰度分别为90%和91%），将透明质酸与甲基丙烯酸酐反应生成HAMA（修饰度34%），将明胶与甲基丙烯酸酐反应生成GelMA（取代度54%），所有产物均通过1H NMR波谱表征确认。（2）墨水配制与3D挤出打印：使用CELLINK BIOX6打印机，配备气动打印头和22G或18G针头，以405 nm光固化模块进行打印。PCL基墨水配方包括35PCL2k:65PEGDA、50PCL2k:50PEGDA和40PCL2k:40PEGDA:20PCL530，内层水凝胶为20Dex:5HAMA:10GelMA。（3）材料表征：包括凝胶含量测定（索氏提取）、溶胀能力测试（PBS中48小时）、单轴和循环压缩力学测试、流变学测试（振荡和剪切速率扫描）、热重分析和差示扫描量热法。（4）降解评估：在PBS（水解）、脂肪酶溶液（酶促）和胎牛血清（FBS）中于37°C进行为期1个月的体外降解研究。（5）细胞相容性评估：使用小鼠神经母细胞瘤（N2a）细胞进行间接接触（提取物测试，遵循ISO 10993-5指南）、直接接触和3D生物打印增殖测试（MTS法和Live/Dead染色）。
**研究结果**
**聚合物前体的表征**：1H NMR波谱证实了Dex-GMA、PCL530-IEMA、PCL2k-IEMA、HAMA和GelMA的成功功能化，修饰度分别为23.3%、90%、91%、34%和54%。
**墨水的配制与挤出**：通过系统优化，确定了三种PCL基配方（35PCL2k:65PEGDA、50PCL2k:50PEGDA和40PCL2k:40PEGDA:20PCL530）和一种右旋糖酐基配方（20Dex:5HAMA:10GelMA）具有最佳打印性能。PCL530-IEMA与PEGDA混合引入亲水性，PCL2k-IEMA提高粘度，GelMA的热致可逆凝胶化改善了打印过程中的形状保持性。
**流变学性能**：振荡流变测试显示，35PCL2k:65PEGDA、50PCL2k:50PEGDA、40PCL2k:40PEGDA:20PCL530和20Dex:5HAMA:10GelMA的交叉温度（G′=G″）分别约为25、23、23.5和21.5°C。所有配方均表现出剪切变稀行为，有助于挤出。
**凝胶含量与溶胀能力**：四种配方的凝胶含量分别为94.95±0.60%、96.23±1.09%、95.55±0.44%和98.47±0.79%，表明交联效率高。PCL基样品在5小时内达到最大溶胀（11.7%-26%），右旋糖酐基样品达到110%的溶胀率。双层管在水中浸泡48小时未观察到结构变形。
**力学性能**：PCL基样品的压缩性能明显优于右旋糖酐样品，杨氏模量约为后者的5倍。35PCL2k:65PEGDA表现出最高的最大压缩应力（11.8±0.97 MPa），而40PCL2k:40PEGDA:20PCL530表现出最高的压缩应变（36.04±1.47%）。循环压缩测试显示，50PCL2k:50PEGDA和40PCL2k:40PEGDA:20PCL530完全恢复到原始形状，而35PCL2k:65PEGDA表现出Mullins效应（应力软化）。20Dex:5HAMA:10GelMA在整个循环中保持最大压缩应力，表现出优异的抗疲劳性和自愈合特性。
**体外降解**：PCL基样品在1个月内未见明显降解，而右旋糖酐基配方在酶促和FBS条件下降解约15%，表明完全降解需数月，与周围神经再生时间尺度（约2.5厘米/月）相匹配。
**热分析**：PCL基样品比右旋糖酐样品具有更高的热稳定性。DSC分析显示，PCL2k-IEMA和PEGDA是仅有的半结晶聚合物，熔融温度范围分别为约26-38°C和11-24°C。
**接触角测量**：PCL基样品表现出相似的接触角（95.10°-97.99°），足以限制外部细胞粘附。右旋糖酐基样品接触角显著较低（76.71±3.46°），确认了其亲水性。
**细胞毒性**：间接接触测试中，除40PCL2k:40PEGDA:20PCL530在第7天和第14天表现出延迟细胞毒性外，所有配方均保持接近100%的细胞活力。直接接触测试中，20Dex:5HAMA:10GelMA在第7天达到95.99±5.55%的细胞活力，显著高于PCL基配方。
**3D生物打印中细胞增殖**：将N2a细胞（3×10?细胞/mL）混合到20Dex:5HAMA:10GelMA中进行的3D生物打印显示，第1、3和5天的增殖值分别为0.775±0.086、0.863±0.156和1.191±0.110，呈现渐进性增长。Live/Dead染色显示第1天和第2天以活细胞为主。
**双层导管的3D打印与可缝合性**：成功打印了双层导管，外层使用50PCL2k:50PEGDA（22G针头），内层使用20Dex:5HAMA:10GelMA（18G针头）。8-0聚丙烯缝合线多次穿过导管，结构完好无损。缝合保持强度为1.05±0.09 N，超过脱细胞神经外膜约0.734 N的缝合保持强度。
**讨论与结论**
讨论部分指出，所测试的配方形成了稳定的聚合物网络，1个月后仅降解约15%，完全降解需数月，这一时间尺度与周围神经再生速率（约2.5厘米/月）良好匹配。PCL和PEGDA在数月内降解，意味着外层在整个再生完成前提供长期结构稳定性。该外层表现出低细胞毒性和最小细胞粘附，减少成纤维细胞附着并防止纤维化。该系统还支持患者特异性定制，并从细胞介导的再生刺激中获益。
研究结论为：成功制备了由外层PCL-IEMA/PEGDA和内层Dextran-GMA/GelMA/HAMA组成的双层导管，该导管具备适合的打印性、机械性能、生物可降解性和细胞相容性以支持神经再生。该系统在未来的体内神经再生研究中具有巨大潜力。所有PCL基配方中，50PCL2k:50PEGDA展现出最佳的机械强度和细胞相容性，综合性能最优。
