神经纤维瘤病研究的进展：动物模型的比较性综述及其在解析肿瘤微环境中的应用价值

《Laboratory Animal Research》：Advancing neurofibromatosis research: a comparative review of animal models and their utility in dissecting the tumor microenvironment

　　

摘要专业翻译 神经纤维瘤病（Neurofibromatosis）是一种以神经系统肿瘤为主要特征的遗传性疾病，主要由NF1或NF2基因突变引起。鉴于神经纤维瘤病遗传背景的复杂性及肿瘤表型的异质性，机制研究高度依赖实验性动物模型。仅基于人类组织的研究无法充分阐明因果关系、时间动态、修饰基因效应或细胞类型特异性对肿瘤发生、进展及微环境调控的贡献。因此，研究者已开发多种动物模型，包括基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse models, GEMMs）、大型动物系统、替代性脊椎动物模型及基于移植的策略。这些实验平台能够实现基因剂量的可控操纵、谱系特异性基因缺失、免疫调节、基质与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分的靶向破坏，以及治疗反应和耐药机制的评价。动物模型已帮助阐明神经纤维瘤病肿瘤发生中细胞自主性与非细胞自主性机制。此外，肿瘤的持续维持与进展需要肿瘤细胞与其周围微环境之间的协调互作。值得注意的是，这些实验系统提供了临床标本无法实现的时间分辨率，证明微环境改变可能先于明显肿瘤形成。上述发现将肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）描绘为疾病的主动贡献者，而非仅仅是肿瘤生长的结果。在本综述中，研究人员评估了当前用于神经纤维瘤病研究的动物模型的实验范围、方法学优势及固有局限性，重点关注其在阐明TME内相互作用及非肿瘤性病变表现方面的应用价值。本工作刻画了各模型特有的优势与局限，以强调动物模型作为假设驱动型研究与转化开发中不可或缺的工具在阐明神经纤维瘤病多方面特征中的持续重要性。

主体内容专业总结

肿瘤细胞内在发病机制

尽管施万细胞瘤、神经纤维瘤和恶性外周神经鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumors, MPNSTs）均起源于施万细胞谱系，但越来越多的证据表明这些肿瘤由不同的致病机制驱动。人类肿瘤与基因工程小鼠模型（GEMMs）的比较分析揭示，NF1和NF2相关肿瘤不仅在起始遗传事件上存在差异，其下游信号依赖性、协同肿瘤抑制基因改变及与非肿瘤细胞群体的相互作用亦不相同。

NF1编码神经纤维蛋白（neurofibromin），一种GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein, GAP），负性调控Ras信号并约束下游通路，包括Ras/MAPK和AKT/mTOR级联。神经纤维蛋白功能缺失导致Ras持续激活，促进异常细胞增殖与存活，从而启动神经纤维瘤的发生。施万细胞谱系中NF1双等位基因缺失组成性激活Ras通路，增加细胞增殖和去分化，构成皮肤性和丛状神经纤维瘤形成的基础。丛状神经纤维瘤通常在胚胎发育期间由施万细胞前体细胞发生NF1双等位基因缺失后发展而来；而皮肤性神经纤维瘤则源于出生后非髓鞘化施万细胞的NF1双等位基因缺失。向MPNST的进展可通过额外遗传改变发生，包括CDKN2A缺失、RB1缺失、TP53/p53失活、PTEN缺失及表观遗传失调。

除Ras调控外，神经纤维蛋白通过Rho-ROCK-LIMK2-cofilin通路调节细胞骨架组织，影响肌动蛋白丝动力学、细胞运动和黏附。神经纤维蛋白缺失增加细胞骨架重塑并通过RhoA/ROCK依赖性信号改变细胞迁移。神经纤维蛋白还作为R-Ras亚家族蛋白的GTP酶激活蛋白。研究表明R-Ras和R-Ras2在神经纤维蛋白缺陷的MPNST细胞中被激活，通过调控参与细胞骨架重塑、囊泡运输、迁移和侵袭的信号网络促进肿瘤进展。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid, LPA）信号可能作为该迁移程序的上游激活因子。MPNST细胞主要表达LPAR1并异常表达LPAR3，LPAR1通过R-Ras/R-Ras2及下游ROCK信号介导LPA诱导的迁移，而LPAR3主要促进肿瘤细胞增殖。LPAR1–R-Ras–ROCK轴在MPNST发病机制中具有重要作用。

神经纤维蛋白的翻译后修饰，如O-GlcNAc糖基化和磷酸化，可在相同或相邻丝氨酸/苏氨酸残基上发生，形成“阴阳”位点，精细调节神经纤维蛋白的Ras-GAP活性及下游信号。在MPNST中，过度激活的Ras信号诱导AKT/mTOR和MAPK通路的同时激活。NPcis小鼠（Nf1^+/-；Trp53^+/- cis）携带染色体11上顺式连锁的Nf1和Trp53无效等位基因，肿瘤常发生野生型等位基因的并发缺失，小鼠自发发展为MPNST和星形细胞瘤。P₀-GGFβ3；Trp53^+/-小鼠结合施万细胞定向的胶质生长因子β3（GGFβ3）过表达与Trp53单倍剂量不足，在保留野生型Nf1的情况下发展高外显率的de novo MPNST，可用于研究MPNST发展的替代分子途径。

Nf1单倍剂量不足还影响神经回路功能。Nf1^+/-小鼠在行为模型中表现出学习、注意和社交行为异常，与Ras过度激活诱导的GABA能神经传递改变有关，并涉及多巴胺能调控。神经纤维蛋白还作为神经系统中cAMP信号的正向调节因子，其缺失可降低脑内cAMP介导的信号，导致NF1模型中观察到的神经发育和行为表型。

神经纤维瘤病2型的发病机制由NF2功能缺失突变驱动，NF2位于染色体22q12，编码肿瘤抑制蛋白merlin（也称为schwannomin）。Merlin与ezrin-radixin-moesin家族结构相关，正常调节细胞增殖、维持接触依赖性生长抑制，并调控PI3K/AKT、Raf/MEK/ERK和mTOR等关键信号通路。NF2肿瘤形成遵循Knudson“二次打击”假说。Merlin还作用于Hippo肿瘤抑制通路的上游，调控细胞生长和凋亡。

神经纤维瘤病研究中应用的动物模型：范围、优势与局限性

动物模型对神经纤维瘤病研究做出了重要贡献，能够实现人类研究中不可行的实验分析。目前已开发多种实验系统，包括GEMMs、大型动物模型、替代性脊椎动物模型和基于移植的策略。

小鼠模型是神经纤维瘤病研究中最广泛使用的实验系统，尤其针对NF1。基于Cre-Lox介导的Nf1条件性缺失的GEMMs提供基因缺失的精确时空控制，适用于研究细胞谱系特异性需求、发育时序和逐步肿瘤进展。GEMMs已用于再现主要的NF1相关肿瘤类型，包括丛状和皮肤性神经纤维瘤、视路胶质瘤和MPNST。条件性小鼠模型还通过最小化脱靶效应和不必要的动物负担来优化3Rs框架。需要注意的是，人类和动物模型中的NF1改变并不总是代表完全基因敲除。小鼠中Nf1完全敲除是胚胎致死的，通常在胚胎第11.5至13.5天之间。

已开发多种类别的NF1相关小鼠模型，包括种系或条件性Nf1突变小鼠、嵌合模型及整合额外癌症相关遗传改变的复合突变模型。GEMMs的关键优势在于能够在特定细胞谱系的空间和时间尺度上精确操纵Nf1缺失，从而系统研究细胞起源假说和肿瘤发展中的阶段特异性需求。Nf1突变小鼠模型还再现了几种临床相关的疾病特征，如视路胶质瘤的发展。

条件性和种系Nf1小鼠模型广泛用于研究NF1的非肿瘤性表现，特别是骨骼和神经发育异常。成骨细胞或破骨细胞特异性Nf1条件敲除小鼠成功再现特征性骨骼病理，包括胫骨弯曲、假关节和骨密度降低。种系或杂合Nf1突变小鼠用于研究NF1的神经和行为表现，包括学习、注意和社交行为缺陷。

基于移植的模型，包括患者来源异种移植（patient-derived xenografts, PDX）和原位异种移植系统，涉及将人神经纤维瘤来源的施万细胞植入免疫缺陷小鼠，从而在受控实验条件下进行人肿瘤细胞体内行为的评估。然而，免疫缺陷宿主的要求限制了此类模型在完全生理条件下研究免疫介导过程和TME相互作用的效用。

尽管小鼠模型具有多功能性，但其固有局限性源于物种特异性生物学和遗传多样性。这些局限性促进了互补性大型动物模型的发展。猪（微型猪）模型作为有价值的神经纤维瘤病大型动物系统，提供比啮齿动物模型更接近人类的解剖和生理相似性。基因工程NF1微型猪，如携带NF1^+/ex42del的模型，再现人类NF1的多个标志性特征，包括牛奶咖啡斑、神经纤维瘤、腋窝雀斑和骨骼异常，并适用于纵向评估和先进成像方法。

替代性脊椎动物模型，如携带NF1直系同源基因nf1a和nf1b突变的斑马鱼，为研究NF1生物学的保守方面提供互补平台。斑马鱼模型在遗传操作、发育研究和快速体内筛选中特别有利，但其与哺乳动物的解剖和免疫学差异限制了其在建模复杂TME和临床疾病表型方面的适用性。

与NF1相比，能够忠实再现NF2相关肿瘤完整解剖和功能谱的GEMMs较少。早期Nf2^+/-小鼠模型表现出明显的物种特异性局限，这些动物主要发展骨肉瘤而非人类NF2特征性的施万细胞瘤。后续研究表明，施万细胞谱系内Nf2条件性双等位基因失活对于再现关键NF2表现是必要的。Postn-Cre；Nf2^flox/flox小鼠发展影响颅神经、脊神经和外周神经的施万细胞瘤，具有完全外显率，组织病理学特征与人类疾病无法区分，并伴有可测量的听力和平衡缺陷。在merlin缺陷的NF2小鼠模型中靶向p21激活激酶（PAKs）的研究表明，Pak1而非Pak2的遗传消融可减少肿瘤负担并延长生存期。解剖学靶向的移植模型也已开发，将施万细胞瘤细胞原位植入小脑桥脑角（cerebellopontine angle, CPA）区域，便于在临床相关解剖背景下研究前庭施万细胞瘤生长，并支持听力损失、平衡障碍、血管生成和治疗反应的纵向评估。这些模型不再现肿瘤起始，但为研究肿瘤引起的神经功能后果和治疗效果提供互补平台。

综上所述，这些实验系统构成神经纤维瘤病研究的互补工具包。动物模型的选择应根据所研究的具体生物学问题，并仔细考虑各模型的实验范围和固有局限性。