《Veterinary Research》：Bovine viral diarrhea virus (BVDV) relies on cellular lipid droplet biogenesis and lipolysis to provide energy for viral replication
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牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是牛最重要的病毒性病原体之一，由于免疫抑制和持续性感染造成严重的经济损失。以往研究表明病毒感染与脂质代谢密切相关，尤其是在脂滴（LDs）的形成和降解方面。然而，BVDV感染的致病机制以及病毒蛋白重编程脂质代谢的分子机制仍不清楚。研究
牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是牛最重要的病毒性病原体之一，由于免疫抑制和持续性感染造成严重的经济损失。以往研究表明病毒感染与脂质代谢密切相关，尤其是在脂滴（LDs）的形成和降解方面。然而，BVDV感染的致病机制以及病毒蛋白重编程脂质代谢的分子机制仍不清楚。研究人员发现，BVDV通过增强新脂质的产生、加速外源性脂肪酸摄取以及提高二酰甘油酰基转移酶（DGAT）依赖的脂肪酸（FAs）酯化作用，增加了细胞内LDs的积累。随后，生成的LDs通过脂肪甘油三酯脂肪酶/激素敏感性脂肪酶（ATGL/HSL）依赖性脂解作用释放游离脂肪酸（FFAs）。这种脂解依赖的FFAs释放被加速，并通过增加LDs与线粒体之间的接触转移至线粒体进行氧化，从而促进病毒复制。此外，BVDV核心蛋白靶向LDs表面，增加并招募脂肪酸合酶（FASN）和ATGL以促进LD动员。同时，核心蛋白与线粒体相互作用，将线粒体与LDs连接起来，促进FAs释放以进行高效的脂肪酸氧化。总之，本研究表明BVDV核心蛋白调控细胞脂质代谢以支持BVDV复制，有助于理解BVDV与宿主细胞相互作用的致病机制。
牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），是有包膜的单股正链RNA病毒，感染牛后可引起呼吸系统疾病、免疫抑制、生殖障碍及持续性感染，导致严重经济损失。脂滴（lipid droplets, LDs）是由中性脂质核心和单层磷脂膜包被的动态细胞器，其生物发生始于内质网，二酰甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase, DGAT）将脂肪酸（fatty acids, FAs）酯化为甘油三酯（triacylglycerol, TAG）储存于LDs中。LDs可通过脂解或脂噬动员释放游离脂肪酸（free fatty acids, FFAs）。既往研究显示多种病毒与LDs关系密切，但BVDV是否以及如何利用LDs和脂质代谢完成复制仍不清楚。因此，本研究旨在阐明BVDV通过调控LDs生物发生和脂解促进病毒复制的分子机制。
研究人员以牛肾细胞（Madin–Darby bovine kidney, MDBK）和牛子宫内膜上皮细胞（bovine endometrial epithelial cells, BEECs）为感染模型，使用BVDV AV67株开展研究，发现BVDV通过增强从头脂质合成、外源性脂肪酸摄取和DGAT依赖性酯化促进LD积累，随后经ATGL/HSL介导的脂解释放FFAs，并增加LD-线粒体接触，使FFAs转移至线粒体进行β-氧化，为病毒复制提供能量。进一步鉴定出BVDV核心蛋白靶向LDs表面，招募脂肪酸合酶（fatty acid synthase, FASN）和脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase, ATGL），并与线粒体相互作用，促进脂质动员和脂肪酸氧化（fatty acid oxidation, FAO）。该研究揭示了BVDV劫持宿主脂质代谢支持病毒复制的新机制，为控制BVDV传播的药物靶点开发提供了理论依据。
技术方法方面，研究人员利用qRT-PCR检测基因表达和病毒RNA；Western blot检测蛋白水平；共聚焦荧光显微镜结合BODIPY 493/503、Nile Red等染料观察LDs形态及与线粒体、溶酶体共定位；采用荧光脂肪酸类似物BODIPY 500/510和BODIPY 558/568 C12进行脂肪酸摄取及LD-线粒体转运示踪；使用脂质测定试剂盒检测TAG、胆固醇、FFA和ATP含量；通过多种药理学抑制剂（如Orlistat、Torin 1、DGAT抑制剂、Atglistatin、CAY10499、Etomoxir等）干预脂质代谢通路；利用质粒转染和免疫沉淀验证核心蛋白与宿主蛋白的相互作用。所有数据采用GraphPad Prism进行统计分析。
**BVDV upregulates LD biogenesis in favor of viral replication**：通过免疫荧光和脂质定量发现，BVDV感染使MDBK和BEECs中LDs数量及面积随时间增加，TAG和总胆固醇升高，脂滴表面蛋白PLIN2和PLIN3表达上调；油酸预处理的细胞LDs进一步增多，且BVDV RNA水平升高，表明增加的LDs促进病毒复制。
**BVDV promotes LD biogenesis by stimulating de novo lipogenesis**：在无血清培养基中BVDV仍诱导LD形成，并上调脂生成基因Acly、Acc1、Fasn和Scd1；FASN抑制剂Orlistat和mTORC1抑制剂Torin 1减少LD数量并抑制病毒复制，而外源棕榈酸可完全逆转Orlistat的抑制作用，证明从头脂质合成途径参与LD生成。
**BVDV increases exogenous fatty acid uptake**：利用荧光脂肪酸BODIPY 500/510摄取实验显示，BVDV感染增强外源脂肪酸摄取，并上调脂肪酸转运蛋白FATP和FABP4的mRNA水平，CD36表达则降低。
**DGAT is necessary for LD biogenesis during BVDV infection**：使用DGAT1抑制剂PF-04620110和DGAT2抑制剂PF-006424439发现，抑制DGAT1几乎完全阻断BVDV诱导的LD形成，DGAT2仅部分阻断；两种抑制剂均剂量依赖地抑制病毒复制，且BVDV上调DGAT1和DGAT2的mRNA表达。
**BVDV mobilizes LDs by promoting lipolysis rather than lipophagy**：Western blot显示BVDV感染导致LC3II和p62同时积累，BafA处理表明自噬通量降低；油酸脉冲追踪实验中，BVDV使LDs持续减少，ATGL抑制剂Atglistatin和HSL抑制剂CAY10499可逆转该减少并抑制病毒复制，而BafA无效。BVDV还上调ATGL和HSL的蛋白及mRNA水平，并增加细胞内FFA含量。
**BVDV enhances the interaction between neutral lipase and LDs instead of increasing LD turnover in lysosomes**：共聚焦分析显示，BVDV感染不改变LD与溶酶体的共定位，却显著增加ATGL和HSL与LDs的共定位，进一步证明BVDV通过中性脂酶介导的脂解而非脂噬动员LDs。
**Redirecting lipid metabolism toward beta-oxidative pathways is critical for BVDV replication**：时间添加实验显示，Orlistat、PF-04620110和CAY10499在进入后阶段抑制BVDV复制；外源棕榈酸可完全逆转这些抑制剂的抗病毒效果及病毒滴度下降。棕榈酰化抑制剂2-BP不影响病毒复制，而CPT1A抑制剂Etomoxir显著抑制病毒复制且棕榈酸不能拯救，并导致LD进一步积累，表明FAO是BVDV复制所必需。
**BVDV promotes the proximity of LDs to the mitochondrial network and enhances fatty acid oxidation**：共聚焦显微镜显示BVDV感染增加LDs与线粒体标记蛋白TOMM20的共定位，线粒体呈碎片化并脱离网络，JC-1染色显示线粒体膜电位去极化；qRT-PCR显示线粒体生物发生相关基因PPAR-A、PGC1-A、TFAM及脂肪酸β-氧化基因CPT1、CPT2、VLCAD、MCAD、SCAD表达上调。
**BVDV accelerates the transfer of FAs from LDs to mitochondria**：Red C12脉冲追踪实验显示，BVDV感染加速荧光脂肪酸从LDs向线粒体转移，Atglistatin阻断该转移，AICAR（脂肪酸氧化激活剂）则促进转移；BVDV降低细胞内Red C12总量，Atglistatin逆转此效应，AICAR增强此效应；ATP水平相应变化，且AICAR剂量依赖地促进BVDV复制。
**BVDV core protein targets LDs to promote the mobilization of LDs**：表达EGFP-core融合蛋白发现，核心蛋白在油酸处理后显著定位于LDs；预测到两个两亲性螺旋AH1和AH2，C端EGFP标签破坏LD定位，提示AH2发挥关键作用。核心蛋白过表达上调脂生成和酯化基因（ACLY、ACC1、FASN、DGAT1、DGAT2）及脂解基因（ATGL、HSL、MGL），并抑制自噬。免疫沉淀显示核心蛋白与FASN、ATGL和TOMM20存在相互作用。
**BVDV core protein links mitochondria to LDs**：共聚焦显示核心蛋白同时与LDs和线粒体共定位，并增加两者之间的接近程度；脉冲追踪显示核心蛋白表达加速Red C12从LDs向线粒体的转移。
**Core recruits ATGL to the surface of lipid droplets**：共转染实验表明，核心蛋白与PLIN2共同定位于LD表面，并将ATGL招募至LD表面，形成新月形共定位结构，促进脂解释放脂肪酸。
讨论部分指出，BVDV感染在早期促进LD形成，后期促进LD分解，这种动态变化可能也是RNA病毒感染的共同特征。从头脂质合成、外源FA摄取和DGAT酯化共同促进LD积累；脂解而非脂噬负责LD动员，其中HSL可能发挥更关键作用。FAO是BVDV复制的重要能量来源，LD-线粒体接触为FA转移提供平台。核心蛋白通过两亲性螺旋锚定LD膜，并与FASN、ATGL和TOMM20相互作用，协调脂质动员。然而，脂质代谢在病毒组装、成熟和释放阶段的作用尚未阐明，具体脂质种类及NS4B、NS5A等其他病毒蛋白是否参与脂质代谢调控仍有待研究。
研究结论部分翻译：本研究揭示BVDV感染促进细胞内LDs的积累，随后病毒通过脂解作用动员LDs。通过增加LDs与线粒体之间的接触，脂解依赖的FFAs被快速转移至线粒体进行氧化，从而促进病毒复制。BVDV核心蛋白靶向LDs，招募FASN和ATGL，促进LDs动员。核心蛋白还与线粒体相互作用，可能为FAs从LDs向线粒体转移提供桥梁。这些发现有助于阐明BVDV感染的致病机制，并确定控制BVDV传播的治疗潜在靶点。
