优化用于评估潜在免疫源性生物制品T细胞应答的体外检测方法

《Archives of Toxicology》：Optimisation of in vitro assays for accurate risk assessment of T-cell responses to biologics with potential immune liabilities

　　

生物制品在疾病治疗中的应用日益广泛，但其临床疗效常因抗药抗体（anti-drug antibodies）和免疫不良反应而受到阻碍。在临床前开发阶段准确预测生物制品的免疫原性，将有助于提高安全性并避免制药公司的经济损失。研究人员开发了一种逐步探索生物制品免疫原性的策略：（1）评估现有外周血单个核细胞（PBMC）刺激试验的敏感性；（2）优化树突状细胞-T细胞（DC: T-cell）共培养试验；（3）利用利妥昔单抗MHCⅡ类结合肽定义免疫表位。研究人员使用健康供者PBMC进行淋巴细胞转化试验（LTT）和IFN-γ ELISpot试验，以评估一组生物制品的T细胞刺激能力。针对时间点、细胞数量和免疫失调对DC: T-cell共培养方法进行了优化，并使用该生物制品组合进行评估。研究人员利用源自利妥昔单抗可变区的16条15聚体肽段生成并鉴定T细胞克隆。初始PBMC试验显示敏感性较低，频繁出现假阴性结果。DC: T-cell试验对生物制品的敏感性有所提高，但在载体对照培养中观察到高背景应答。试验条件的优化降低了背景计数，并增加了试验的动态范围和敏感性。CD4⁺T细胞克隆在增殖和细胞因子释放试验中对两条15聚体利妥昔单抗肽段有应答。这些数据表明，DC: T-cell共培养和克隆方法应与表位预测工具联合使用，以评估具有潜在免疫源性风险的生物制品的T细胞应答。实施上述逐步策略可在开发早期识别高风险分子，并突出分子的“热点”区域以进行风险缓解。

**论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

治疗性蛋白药物（生物制品）已广泛应用于多种疾病的治疗，显著改善了患者生活质量和生存期。然而，随着临床使用的扩大，免疫原性相关不良反应日益受到关注。生物制品的免疫原性可导致抗药抗体（anti-drug antibodies, ADA）产生，从而降低甚至丧失药物疗效；严重时可引发过敏反应、严重皮肤反应或内脏器官损伤等超敏反应（Type β反应）。这些不良反应不仅危害患者安全，还可能导致有效药物撤市，造成巨大的经济损失。

生物制品超敏反应的始动环节是抗原提呈细胞（antigen presenting cells, APC）将加工后的肽段展示于MHC分子表面，供T细胞识别。T细胞活化后辅助B细胞产生抗体，并释放细胞因子激活巨噬细胞或细胞溶解介质，直接促进组织损伤。尽管目前已发展出多种计算机模拟（in silico）工具用于预测治疗性蛋白的T细胞表位和MHC结合能力，但MHC相关肽段的检测往往会高估免疫原性风险——许多肽段因T细胞受体（TCR）库缺乏相应特异性而被忽视，另一些则诱发调节性应答。实际上，仅少数由MHC呈递的肽段能够激活初始T细胞或效应T细胞并参与超敏反应。因此，迫切需要建立能够在临床前阶段准确预测治疗性蛋白免疫原性风险的T细胞试验方法，以减轻患者负担并防止制药公司的重大经济损失。

现有免疫原性检测方法缺乏标准化，不同实验室的结果差异显著。外周血单个核细胞（PBMC）刺激试验和树突状细胞-T细胞（DC: T-cell）共培养试验对免疫靶向性生物制品常出现假阴性结果，无法准确反映临床实践中观察到的免疫原性。此外，免疫检查点阻断抗体（如抗PD-L1、抗PD-1、抗CTLA4）已被整合到DC: T-cell共培养体系中以模拟体内免疫失调状态，但活化阈值尚未建立，限制了其在候选药物免疫原性风险评估和表征中的应用。因此，该研究旨在系统优化DC: T-cell共培养试验条件，建立一套逐步式（stepwise）免疫原性评估策略，以提供更高的敏感性和免疫原性表位的机制学信息。

**二、研究目的**

研究人员旨在评估现有PBMC刺激试验和DC: T-cell共培养试验对一组具有不同临床免疫原性水平的治疗性蛋白的检测敏感性，对DC: T-cell共培养试验进行系统优化以提供适宜的敏感性，并利用利妥昔单抗（rituximab）来源的MHCⅡ类结合肽验证T细胞克隆试验在免疫原性风险评估中的应用价值。

**三、主要技术方法**

研究人员从利物浦药理学样本库（Liverpool Pharmacology Biobank）招募健康供者，获得伦理批准和书面知情同意。部分白细胞锥（leukocyte cones）获取自NHS血液输血服务中心。主要技术方法包括：（1）淋巴细胞转化试验（lymphocyte transformation test, LTT）和IFN-γ ELISpot试验——利用健康供者PBMC评估一组生物制品的T细胞刺激能力；（2）单核细胞来源树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells, moDCs）的生成——CD14⁺单核细胞经磁珠分选（MACS）后，在GM-CSF和IL-4存在下分化5-6天，再用LPS和TNF-α诱导成熟；（3）DC: T-cell共培养试验——采用96孔微量多孔板（TMWA）和24孔板两种格式，进行12天共培养后以新鲜moDC和梯度浓度抗原再刺激48小时，通过[³H]-胸苷掺入法检测增殖；（4）试验条件优化——包括DC抗原脉冲时间（1h、4h、24h）、DC: T-cell比例（1:2至1:50）以及免疫检查点阻断抗体（抗PD-L1、抗PD-1、抗CTLA4）的添加与否和浓度梯度；（5）Luminex多重微球阵列检测——定量检测再刺激后上清中IFN-γ、IL-2、IL-5、IL-13、IL-10、IL-17、IL-22、CD40L和TNF-α等细胞因子分泌；（6）T细胞克隆生成——PBMC与利妥昔单抗来源肽库（rituximab peptide pool, RPP，含16条15聚体肽段）培养14天后进行有限稀释克隆，经系列扩增后鉴定抗原特异性；（7）流式细胞术——通过CD4-FITC和CD8-PE荧光抗体鉴定T细胞克隆表型；（8）ELISpot试验——检测IFN-γ、IL-5、IL-10、IL-13、IL-22和颗粒酶B（granzyme B）分泌；（9）MHC阻断试验——使用抗HLA-I类（DX17）、HLA-II类（Tu39）和HLA-DR（G46-6）抗体确定T细胞克隆的MHC限制性；（10）HLA基因分型——对供者DNA进行I类和II类HLA多态性外显子测序。

**四、研究结果**

**（一）治疗性蛋白的初始免疫原性筛查**

研究人员使用LTT和IFN-γ ELISpot对一组生物制品进行PBMC活化评估。结果显示，除AZD1402外，浓度依赖性增殖罕见，AZD1402在4例供者中仅1例出现响应。IFN-γ分泌方面，AZD1402在4例供者中3例出现中度响应，而其他生物制品未观察到类似响应。鉴于PBMC试验敏感性低，研究人员转而使用TMWA DC-T细胞致敏方案评估免疫原性。AZD1402在再刺激后呈现弱增殖响应，但无统计学显著性，高背景掩盖了药物特异性增殖。TMWA未能检测到英夫利昔单抗（infliximab）的响应——该化合物在临床中已知具有T细胞介导的不良事件——引发了重大关注。KLH（钥孔血蓝蛋白，常用的免疫原性评估阳性对照）仅在3例供者中1例出现统计学显著增殖。这些结果提示TMWA缺乏准确评估生物制品体外T细胞活化的敏感性。

**（二）DC脉冲提高T细胞致敏试验对KLH的敏感性**

研究人员将TMWA与传统的24孔板共培养格式进行比较，并采用DC脉冲（成熟前4h抗原预孵育）以增强抗原摄取。结果显示，脉冲DC后对KLH的敏感性显著提高，3/3供者在再刺激后至少2个测试浓度下出现统计学显著T细胞增殖，而未脉冲的TMWA未观察到显著增殖。然而，使用脉冲moDC的24孔板格式评估一组生物制品时，KLH在4/4供者中均出现显著增殖，但刺激指数（SI）≥1.5的供者数量有限（10μg/mL时1/4，40μg/mL时2/4）；英夫利昔单抗仅在1例健康供者中检测到显著增殖但未达到SI阈值；其他治疗性蛋白未观察到药物特异性增殖。这表明该试验仍缺乏敏感性。

**（三）DC: T-cell共培养试验的系统优化**

优化过程采用逐步方法（Fig. 3A），每次修改后评估检测T细胞活性的准确性，仅在敏感性/准确性提高时在后续试验中保留。首先评估KLH DC脉冲的不同时间点（1h、4h、24h），24h脉冲因背景增殖水平降低、动态范围增大和阳性响应数量增加而被采纳。其次评估DC: T-cell比例（1:2、1:5、1:10、1:12.5、1:25和1:50），结果显示1:10、1:12.5、1:25和1:50比例在全部供者中均观察到阳性增殖，但1:25和1:50比例背景升高，1:2和1:5比例敏感性下降。1:10比例在背景计数和刺激指数间取得最佳平衡（3/3供者SI≥4），被选定用于后续试验。第三，评估免疫检查点阻断的影响——包括去除PD-L1阻断、滴定PD-L1抗体浓度（1、2.5、5、10μg/mL），以及联合添加PD-1和/或CTLA4阻断抗体。结果显示，去除PD-L1阻断后敏感性和背景均显著改善，3/3供者出现阳性响应，最大SI>15。因此，最终确定的优化方案为：24h DC脉冲、1:10 DC: T-cell比例、不添加免疫检查点阻断抗体。

**（四）优化条件下生物制品免疫原性再评估**

使用最终优化的DC-T细胞试验对10例健康供者进行生物制品免疫原性再筛查。KLH在10/10供者中产生强阳性增殖响应，其中9/10供者在最低测试浓度（1μg/mL）即出现响应。利妥昔单抗在8/10供者中诱导弱至中度阳性响应。西妥昔单抗在3/10、依那西普在1/10供者中出现低水平增殖。曲妥珠单抗（非免疫原性阴性对照）仅在1/10供者最高浓度处出现弱阳性。细胞因子分泌方面，KLH诱导强IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-10和IL-2分泌，但未检测到IL-17、IL-22、CD40L和TNF-α。利妥昔单抗在6/10供者中检测到少量IFN-γ、IL-5、IL-13和IL-2；英夫利昔单抗、西妥昔单抗和曲妥珠单抗在2/10供者中有少量分泌；阿达木单抗和依那西普未检测到分泌。HLA分析显示，该队列的HLA-DRB1和HLA-DPB1超级家族覆盖欧洲人群常见等位基因，但9/10供者携带至少一个HLA-DQB1*04:01拷贝，供者数量有限限制了人群水平的关联分析。

**（五）利妥昔单抗肽特异性T细胞克隆的生成与鉴定**

基于优化的T细胞致敏试验中利妥昔单抗阳性响应（8/10供者），研究人员将PBMC与16条利妥昔单抗衍生肽段组成的RPP共培养14天，经有限稀释和系列扩增生成T细胞克隆。结果显示，2/3供者共获得22个对RPP有增殖响应的T细胞克隆。这些克隆表现出浓度依赖性RPP特异性增殖和/或IFN-γ分泌。克隆不针对完整利妥昔单抗蛋白产生增殖响应。通过4肽混合池筛选，14个RPP响应性克隆中9个对PP2响应、5个对PP4响应。进一步单肽鉴定发现，所有PP2响应性克隆均对P5（序列TPGRGLEWIGAIYPG，源自重链第40-54位氨基酸）响应，PP4响应性克隆对P15（序列SSPKPWIYATSNLAS，源自轻链第41-55位氨基酸）响应。

**（六）RPP响应性T细胞克隆为CD4⁺且受HLA-DR限制**

表型分析显示，18个HD39来源的RPP克隆中16个为CD4⁺、2个为CD8⁺；HD37来源中各有1个CD4⁺和1个CD8⁺克隆。2个CD8⁺克隆均未充分扩增以进行MHC限制性试验。MHC阻断试验显示，MHCⅡ类阻断完全消除CD4⁺克隆的P15特异性增殖响应，而MHCⅠ类阻断几乎无影响。功能分析表明，6/6克隆均分泌IFN-γ，5/6克隆分泌不同水平的IL-5、IL-13、IL-10和颗粒酶B，IL-22仅在3/6克隆中分泌（2个P5特异性和1个P15特异性）。P5和P15分别对应利妥昔单抗重链和轻链的CDR2区域（始于第49位氨基酸），其余氨基酸位于框架区，但与人IgG1同种型相比仍存在多处突变。P15对多个HLA-DR单倍型（DR1、DR11、DR15）显示极高结合亲和力，P5仅与DR1和DR15中等结合。HLA-DR3和DR10结合未测量。

**五、讨论与结论**

研究人员指出，PBMC试验和未经优化的DC: T-cell共培养试验对高免疫原性蛋白（除利妥昔单抗外）缺乏足够敏感性，对于TNF-α拮抗剂等免疫调节性治疗药物，因其直接抑制靶标，试验中未能复现临床免疫原性风险。24小时DC脉冲可能通过增加抗原内化和免疫原性肽段呈递来降低背景、扩大动态范围。DC: T-cell比例从1:12.5调整至1:10导致的背景显著差异提示，细胞计数的微小误差可能转化为相对背景的显著性差异。免疫检查点阻断在本文条件下未提高灵敏度，相反增加了背景，故从最终方案中移除。对于TNF抑制剂类药物的阴性结果，可能的解释包括其作用机制直接抑制T细胞活化，以及体外环境中缺乏患者体内存在的炎症信号。未来研究可考虑加入TNF-α等促炎因子以模拟特定疾病状态。研究人员强调，优化的DC: T-cell试验目前形式尚不足以独立作为预测性工具，但可作为确证性工具用于临床开发中免疫相关不良事件（irAEs）的监测。T细胞克隆方法利用肽段克服了免疫靶向生物制品的作用机制干扰，可精确定义HLA结合肽段并表征T细胞应答的性质。分泌Th1/Th2/Th17相关细胞因子及细胞溶解分子的CD4⁺T细胞克隆可能参与ADA的T细胞依赖性产生及利妥昔单抗治疗患者中观察到的T细胞介导毒性。

研究结论：本研究优化并验证了新型DC: T-cell共培养试验和T细胞克隆方法用于探索治疗性蛋白免疫原性。尽管对于免疫抑制性治疗药物仍存在局限性，该工作凸显了T细胞试验在治疗性蛋白开发中的应用潜力。未来的免疫原性风险评估应采取整体性策略，将优化后的T细胞致敏试验与已验证的PBMC试验（用于检测预先存在的记忆性T细胞）及计算机模拟方法联合使用，以全面评估生物制品T细胞介导不良事件的风险。本研究发表于《Archives of Toxicology》。