OTUD1缺失通过促进肝细胞中HSP90α泛素化降解缓解代谢功能障碍相关脂肪性肝病

《Molecular Biomedicine》：Ovarian tumor domain-containing protein 1 deficiency attenuates metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease by promoting the ubiquitination of HSP90α in hepatocytes

　　

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）是全球最常见的慢性肝病，但获批药物治疗仍有限。卵巢肿瘤结构域包含蛋白1（ovarian tumor domain-containing protein 1，OTUD1）参与代谢调控，但其在MASLD中的作用不明。研究人员发现，MASLD患者肝组织及高脂饮食（high-fat diet，HFD）小鼠中OTUD1表达显著升高，该结果获两个独立GEO队列（GSE24807、GSE126848）支持。系统性Otud1敲除小鼠研究表明，Otud1缺陷在HFD及高脂甲硫氨酸受限胆碱缺乏（high-fat, methionine-restricted, choline-deficient，HFMCD）饮食条件下可明显缓解胰岛素抵抗与炎症。为评估肝细胞特异性及治疗相关性，研究人员用AAV8-TBG-shOtud1沉默肝细胞Otud1，可显著改善HFMCD诱导的脂肪性肝炎。机制上，整合互作组学鉴定热休克蛋白90α（heat shock protein 90α，HSP90α）为OTUD1直接底物：OTUD1结合HSP90α并去除其K283位K48连接多聚泛素链，从而阻止蛋白酶体降解并增强其稳定性；催化失活突变体OTUD1-C320S不能稳定HSP90α或促进脂质沉积。转录组学显示，OTUD1过表达在油酸/棕榈酸（oleic acid/palmitic acid，OA/PA）处理的LO2细胞中激活脂质代谢与炎症通路。上述结果确立OTUD1通过OTUD1–HSP90α轴驱动MASLD进展，并提示OTUD1可作为代谢肝病潜在治疗靶点。

研究背景方面，MASLD已从非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）新命名框架下的重大公共卫生问题，涵盖从单纯肝脂肪变到代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH），并可进展为纤维化、肝硬化及肝细胞癌。目前获批药物有限，病理机制复杂且异质性强。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）通过去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）调控蛋白稳定性，在肝病中作用日益受到关注；然而DUBs在MASLD中的功能谱和可控药性仍不清楚。OTUD1属卵巢肿瘤蛋白酶（ovarian tumor protease，OTU）家族，可调控STAT3、p53、YAP等，但其在MASLD中的表达模式、功能及底物均未定义。HSP90α作为分子伴侣，可稳定脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）并经LXRα促脂生成，也参与炎症，但OTUD1是否通过HSP90α驱动MASLD尚属空白。因此，研究人员假设OTUD1以其去泛素化活性促进MASLD，并经由稳定致病性调控因子实现，从而开展本项研究。

主要关键技术方法方面，研究人员使用人MASLD肝组织与正常对照、GEO数据集GSE24807及GSE126848进行表达验证；以HFD和HFMCD饲喂小鼠建立体内模型；用CRISPR/Cas9构建全身性Otud1敲除小鼠，用AAV8-TBG-shOtud1实现肝细胞特异性敲低；细胞水平以OA/PA处理LO2、HepG2、Huh7细胞模拟脂变；通过Co-IP/MS鉴定互作蛋白，外源与内源Co-IP及免疫荧光验证OTUD1与HSP90α结合定位；用环己酰亚胺追踪半衰期、MG132阻断降解、K48/K63泛素链及K283点突变解析去泛素化机制；以慢病毒过表达/敲除LO2细胞行BODIPY脂质滴检测与回补实验；并对OA/PA处理的LO2细胞做转录组学与基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。

研究结果如下。OTUD1 expression levels are increased in patients and mice with MASLD：研究人员通过小鼠肝脏RNA-seq、GEO队列及人肝组织检测，发现Otud1/OTUD1在HFD小鼠肝、OA/PA处理LO2细胞及MASLD患者中上调，且主要见于肝脏而非脂肪组织，免疫荧光定量与NAS评分相关，提示OTUD1在MASLD肝细胞中被激活。Otud1 deletion alleviates HFD-induced hepatic steatosis：全身性Otud1^?/?小鼠喂HFD后，体重增幅、肝体比、AST/ALT、血糖耐受与胰岛素敏感性、血浆和肝脏甘油三酯均改善，H&E与Oil Red O显示脂肪变减轻，表明Otud1缺失缓解HFD诱导肝脂肪变与代谢异常。Otud1 deletion alleviates HFMCD-induced hepatic steatohepatitis：HFMCD模型中Otud1^?/?小鼠肝损伤标志物降低，糖耐量改善，Oil Red O与Sirius red显示脂聚积和纤维化减少，NAS下降，证明Otud1缺失保护HFMCD诱导的脂肪性肝炎。OTUD1 interacts and colocalizes with HSP90α in hepatocytes：Co-IP/MS、外源/内源Co-IP及LO2、HepG2免疫荧光显示OTUD1与HSP90α物理结合且亚细胞共定位，确立HSP90α为OTUD1互作蛋白。OTUD1 deubiquitinates and stabilizes HSP90α by removing its K48-linked ubiquitin chains：剂量过表达升HSP90α蛋白，CHX实验延长其半衰期；OTUD1削减HSP90α总泛素化且C320S失效；OTUD1优先去除K48连接链，点突变K283削弱去泛素化；STUB1促HSP90α泛素化，OTUD1拮抗之，结论为OTUD1经K283 K48链防蛋白酶体降解而稳定HSP90α。OTUD1 promotes lipid accumulation through HSP90α in hepatocytes：OA/PA下OTUD1过表达促脂质滴、激活脂代与炎症通路，C320S失效；OTUD1-KO减脂聚，回补HSP90α恢复表型，说明HSP90α是OTUD1促脂生成下游效应分子。Otud1 deletion alleviates lipogenesis and inflammation in mice：Otud1^?/?小鼠血清IL-6、TNF-α下降，F4/80巨噬浸润减少，M2标记升M1降；肝HSP90α、p65、FASN、ACC1、SREBP1及对应mRNA降低，表明缺失同时抑炎并关闭脂生成程序。Hepatic Otud1 knockdown by AAV8-TBG-shOtud1 alleviates diet-induced steatohepatitis in mice：肝特异敲低不改变摄食体重，但降ALT/AST、肝TG、改糖耐、减脂与纤维化，并同步下调HSP90α–p65、脂生成因子，提供肝向OTUD1抑制的治疗概念验证。

讨论部分总结：研究人员指出，本研究将OTUD1归入促病性DUB，与USP14等共同通过稳定HSP90α推动MASLD/MASH，HSP90α是可被不同DUB调控的蛋白稳态枢纽。OTUD1功能具情境与底物依赖性：在肝缺血再灌注中稳NRF2具保护性，在慢性代谢炎症中稳HSP90α致脂炎；本模型未见NRF2下调，故NRF2非主要机制。局限性包括仅用雄性小鼠、未做代谢笼测能量消耗、巨噬细胞与全身细胞因子贡献未完全分离。总体意义在于揭示OTUD1–HSP90α为新型可成药通路。

结论部分翻译：总之，本研究鉴定出去泛素化酶OTUD1为MASLD/MASH中此前未被认识的促进因子，其通过去除HSP90α第283位赖氨酸上的K48连接多聚泛素链、拮抗E3连接酶STUB1来稳定HSP90α。此处阐明的OTUD1–HSP90α调控轴，代表一条用于代谢肝病治疗的新型且潜在可成药通路。