基于人iPSC的可灌注无膜神经血管单元芯片：连接脑类器官与血脑屏障

《Lab on a Chip》：A human iPSC-based perfusable and membrane-free neurovascular unit-on-chip connecting brain organoids to the blood–brain barrierOpen Access

　　

血脑屏障（BBB）通过限制有害血源性因子的进入来保护中枢神经系统，但这种选择性也积极限制了治疗药物向大脑的递送。由于BBB功能受到神经血管单元（NVU）内动态相互作用的塑造，尤其是脑内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞之间的相互作用，因此需要能够在受控环境中同时捕获屏障特性和神经血管串扰的人源相关模型。本研究展示了一种新型基于人诱导多能干细胞（iPSC）的NVU芯片，该芯片通过无膜、水凝胶界面，将可灌注的血管样BBB隔室与相邻的开放顶室（容纳人脑类器官（hBO））耦合。该设计能够在屏障-组织边界处实现BBB和实质成分的近距离共培养，同时允许直接的细胞间相互作用，而无需人工多孔膜。利用该平台，研究人员证明了稳定的芯片上共培养，并显示hBO来源的星形胶质细胞可以萌发、向BBB隔室迁移并与内皮细胞建立直接接触，重现NVU结构。该系统为在健康和疾病状态下建模NVU生物学，以及评估BBB穿透性和候选治疗药物对hBO的下游效应，提供了一个人特异性框架。

**论文解读：基于人iPSC的可灌注无膜神经血管单元芯片连接脑类器官与血脑屏障**

**一、研究背景与现存问题**

多种神经退行性疾病的有效治疗手段仍然缺乏，其开发受阻于两方面因素：对疾病机制的理解不足，以及难以测试潜在治疗化合物能否进入并影响大脑。外周物质进入大脑受到血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）的严格调控。BBB由脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells, BMECs）构成，并由周细胞和星形胶质细胞终足支持其屏障功能。尽管BBB通过紧密连接（tight junctions, TJs）和有限转胞吞作用阻止有害血源性物质进入大脑，但它同时也限制了药物通过选择性外排转运体跨屏障入脑。

现有模型存在明显局限。动物模型不能完全重现人BBB功能与疾病，这导致动物中有效的药物转化成功率较低。基于人的体外模型，如二维细胞单层或膜基共培养，缺乏脑血管及其周围细胞和结构（即神经血管单元，neurovascular unit, NVU）的复杂性和功能性。近年来，微流控设备的引入使BBB体外模型在三维性和流体动力学方面有所提升，但这类BBB芯片模型往往缺乏与脑实质的直接连接。人脑类器官（human brain organoids, hBOs）能提供类似大脑的微环境，但其天然缺乏血管，限制了神经血管过程的研究，并因氧和营养扩散不足而形成坏死核心。虽然血管化hBOs通过共培养或融合策略有所改进，但新生血管的转胞吞率较高、屏障不成熟，且血管化hBOs不具备功能成熟的BBB。

因此，亟需一种既能捕获BBB屏障特性、又能重现NVU内细胞间相互作用的人源可控模型。该研究旨在构建一个不依赖血管生成、功能可控且复杂的三维人NVU体外模型，以支持健康与疾病状态下的NVU建模，以及药物穿越BBB后对脑环境影响的研究。

**二、研究内容与结论**

研究人员设计并开发了一种名为CONNECT的微流控芯片，这是一种基于人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）的共培养系统。该系统将切片hBOs与代表BBB的生物制造血管功能连接。CONNECT芯片包含五个共培养单元，每个单元由一个具有血管样几何结构的BBB通道和一个开放顶部的hBO腔室组成，两者通过毛细压力屏障（capillary pressure barrier, CPB）分隔。CPB负载水凝胶，使hBO腔室和BBB通道之间实现无膜分隔，允许直接细胞-细胞接触，同时保持各自的隔室化。芯片利用重力驱动的双向流动提供流体剪切应力，无需外接泵或管路。

研究人员通过一系列实验验证了该平台的功能。首先，在膜插入物共培养中证明了hBO切片来源的星形胶质细胞能向ECs萌发并物理接触。随后，在CONNECT芯片上优化了hBO切片培养条件，证实了星形胶质细胞可从切片迁移并进入水凝胶。接着，研究人员在芯片上构建了BBB隔室，将iPSC来源的脑周细胞（hiBPCs）包封在水凝胶中，并将iPSC来源的内皮细胞（hiECs）接种于通道内，形成内皮单层。最后，将hBO切片与BBB隔室共培养，观察到了星形胶质细胞与内皮细胞的直接接触以及终足样结构对内皮单层的包裹。功能验证显示，hiBMECs表现出低渗透性和P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）外排活性，并能在流动条件下沿流向排列。

该研究的主要结论是：CONNECT芯片是首个将hBO技术与功能性血管芯片相结合且不依赖血管生成的微流控系统。该无膜设计允许hBO与单个可灌注血管样结构直接相互作用，同时该结构可获得并维持BBB特性。该系统为NVU生物学建模、药物BBB穿透性评估及候选药物对脑类器官下游效应的研究提供了一个人特异性的框架。

**三、关键技术与方法**

研究人员使用了以下关键技术方法：

1. **细胞分化**：将iPSC系分化为na?ve内皮细胞（hiECs）和神经嵴来源的脑周细胞（hiBPCs），并通过CHIR处理诱导hiECs向脑微血管内皮细胞（hiBMECs）特化。hBOs通过无引导和皮层引导两种分化方案生成。使用来自健康供体和阿尔茨海默病患者的多种iPSC系（包括APOE4/4基因型及其CRISPR-Cas9校正系）。
2. **hBO切片**：使用振动切片机将hBOs切片为200–250 μm厚的活体切片，以避免坏死核心并改善营养获取。
3. **微流控芯片设计与制造**：使用立体光刻3D打印技术制造BioMed Amber Resin芯片，利用毛细压力屏障（CPB）固定水凝胶，实现无膜分隔。
4. **流体模拟**：采用集总参数分析模型模拟重力驱动流动的流速和壁剪切应力。
5. **免疫细胞化学与成像**：对芯片和膜插入物培养物进行固定、染色、组织透明化和共聚焦/宽场显微镜成像。使用AAV介导的GFAP启动子驱动eGFP表达来标记星形胶质细胞。
6. **屏障功能分析**：通过测量荧光示踪剂（70 kDa葡聚糖、罗丹明123）的表观渗透系数（Papp）评估屏障完整性，并通过维拉帕米抑制实验评估P-gp活性。
7. **细胞形态分析**：使用Polarity-JaM软件对VE-钙黏蛋白染色图像进行细胞分割、方向统计和形态学特征分析。

**四、研究结果**

**1. hBO切片来源的星形胶质细胞在膜共培养中向ECs萌发并物理接触**

在Transwell膜插入物上，将ECs单层（hCMEC/D3或hiECs）与hBO切片共培养。GFAP阳性星形胶质细胞突起穿过0.4 μm孔径膜并与ECs形成物理接触，获得概念验证。

**2. 无膜微流控芯片的设计实现水凝胶分隔的开放腔室与血管样通道**

CONNECT芯片具有开放顶部设计、玻璃底部、五个共培养单元。CPB的弯曲边缘使水凝胶形成弯月面，产生管腔形状的BBB通道。重力驱动的双向流动产生峰值流速8.64 nL/s，峰值壁剪切应力2.86 dyn/cm2。

**3. 芯片上hBO培养的优化实现hBO切片来源星形胶质细胞的萌发和迁移**

早期完整hBO在芯片上静态培养受限，成熟完整hBO（200+ DIV）萌发能力差。新鲜切片的皮层hBO（239 DIV）能附着于芯片玻璃底部并萌发细胞。AAV转导证实部分迁移细胞为GFAP阳性星形胶质细胞。

**4. hiECs在水凝胶负载的CPB上形成单层并接触hiBPCs**

hiBPCs包封于胶原I水凝胶并负载于CPB，hiECs接种于BBB通道，在胶原IV涂层上形成单层。CHIR处理诱导BMEC特化。共聚焦显微镜证实hiECs完全内皮化凝胶界面，hiBPCs向hiECs迁移并建立物理接触点。

**5. hBO来源星形胶质细胞包裹hiBMECs并随时间增加GFAP强度**

在hBO、hiEC和hiBPC三培养中，星形胶质细胞向BBB通道萌发并迁移。所有共培养条件均观察到GFAP-GFP荧光强度随时间显著增加。免疫细胞化学和3D重建显示GFAP阳性星形胶质细胞与hiBMECs直接接触，并形成包裹内皮单层的终足样结构，重现神经胶质界膜形态。

**6. hiBMECs在芯片上获得BBB特性并沿流动方向排列**

70 kDa葡聚糖渗透性实验显示hiECs和hiBMECs均呈低渗透性，且不受hBO存在影响。P-gp活性实验显示仅hiBMECs具有显著P-gp活性，hiECs无此活性。在流动条件下，hiBMECs沿流向排列，极性指数、长宽比和形状指数增加，圆形度降低，但VE-钙黏蛋白表达不变。

**五、讨论与结论**

**讨论总结**：CONNECT芯片是首个将hBO技术与非血管生成依赖的功能性血管芯片相结合的微流控系统。该模型的优势在于纳入了三维多细胞脑样环境，使屏障特性可被NVU其他细胞类型增强和维持。研究证实hiBPCs可诱导hiBMECs的P-gp活性。hBO来源星形胶质细胞能通过水凝胶接触ECs而不破坏单层或诱导血管生成，这避免了血管生成导致的高通透性。hBO与ECs/hiBPCs共培养增加GFAP表达，提示内皮和周细胞可能通过分泌LIF和VEGF等因子促进星形胶质细胞GFAP表达。芯片设计利用毛细压力固定效应形成单尖锐边缘通道，更好地代表圆柱形血管几何结构。开放顶部设计支持样本收集和下游分析。

**研究结论**：CONNECT芯片是一个多功能NVU模型，可用于药物筛选的多方面评估，包括BBB穿越、药物对血管和脑实质的影响，以及识别受药物影响的脑细胞类型。该系统完全基于iPSC，为疾病建模和个性化医疗提供了平台。未来工作将使用标准中枢神经系统穿透性和非穿透性化合物组合进行基准测试，并进一步整合紧密连接标记物进行分子验证。

**局限性**：研究承认与体内BBB相比仍存在差异，包括无法完全内皮化整个BBB通道表面、星形胶质细胞和周细胞的覆盖率相对较低、通道直径大于体内微血管、CPB尺寸大于基底膜，以及胶原I水凝胶不能准确代表脑基底膜组成。