《Translational Neurodegeneration》：What can we learn on ALS pathophysiology from iPSC-derived motor neurons harbouring TARBDP mutations: a systematic review
肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者的退行性运动神经元以细胞质聚集体的积累为特征，这些聚集体特异性富集于泛素化的TDP-43。TDP-43主要表达于细胞核，部分表达于细胞质以执行其在RNA代谢中的功能，但导致TDP-43在疾病中聚集的确切机制尚未阐明。揭示这些过程可能使我们更接近有效的药物开发，而这正是ALS研究领域所严重缺乏的。诱导多能干细胞（iPSCs）为直接在ALS患者相关人类遗传背景下研究ALS发病机制提供了有前景的平台。自2012年以来，已有超过30项公开发表的研究探讨了来自携带TARDBP基因（编码TDP-43蛋白）突变的ALS患者的iPSC来源运动神经元中细胞和亚细胞特征的改变。然而，所得结果之间存在差异，这使得人们对该模型用于ALS疾病建模及其在药物开发中的相关性产生质疑。因此，该领域需要一份清晰详细的布局和总结，涵盖所有使用TARDBP突变iPSC来源运动神经元进行ALS建模的已发表数据。在这项系统综述中，研究人员分析了所有针对源自TARDBP ALS患者的iPSC来源运动神经元进行的表型评估，涵盖这些细胞的形态、功能和活力。研究人员还通过比较探讨TDP-43和神经丝聚集以及应激颗粒动力学的研究，分析了该模型是否在体外重现ALS病理。重要的是，研究人员比较了所有纳入研究的技术细节，如分化方案、所用运动神经元的年龄和纯度以及量化方法，以讨论这些参数如何影响观察到的表型。最后，研究人员还将综述范围扩展至所有其他由TARDBP iPSCs分化而来的不同细胞类型，强调了TDP-43-ALS病理生理学中的非细胞自主机制。通过整合各项研究的发现，本综述识别了共性与差异，探讨了方法学进展与局限性，并强调了通过TARDBP iPSC来源模型所揭示的潜在治疗靶点。
背景
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种神经退行性疾病，其特征是大脑和脊髓中运动神经元（MNs）的进行性变性。尽管ALS被视为罕见病，年发病率为每10万人1.5至2例，但由于其快速进展和致命性，对患者、家庭及社会的影响巨大。运动神经元丢失首先导致肌肉萎缩和随意运动丧失，并在2至5年内因全身瘫痪和呼吸衰竭而死亡。自1869年法国神经学家Jean-Martin Charcot首次描述该病以来，ALS科学研究已持续一个半世纪。尽管付出了大量努力，ALS的确切分子机制仍不清楚。
理解ALS病理生理学的挑战主要源于ALS患者在临床表现和遗传变异方面均存在显著异质性。ALS日益被认为不是一种单一疾病实体，而是由遗传和环境风险因素组合引起的临床综合征，涵盖多种组织病理学改变和临床表现。目前已鉴定出超过40个ALS相关基因，包括SOD1、C9orf72、TARDBP和FUS，每个基因对疾病发生和进展的贡献不同。这种遗传多样性导致驱动疾病的分子机制各异，使得开发准确代表ALS发病机制的统一模型变得困难。ALS已在所有常用的动物模型中得到研究，为疾病理解贡献了大部分知识；然而，这些模型常常无法完全重现人类疾病。具体而言，ALS小鼠转基因模型已被广泛研究，但它们仅能处理家族性ALS的理解，而无家族史的散发性ALS占患者的90%。
ALS的治愈尚未实现，现有治疗如利鲁唑和依达拉奉仅在有限亚群中有效，且生存获益短暂。近年来，靶向基因治疗已出现，包括2023年获批用于SOD1相关ALS的反义寡核苷酸tofersen，其展示了神经丝（NF）水平的显著降低——这是神经退行性变的生物标志物。其他治疗策略正在研究中，包括马赛替尼（在临床试验中显示出令人鼓舞的结果）以及线粒体和内质网应激靶向联合疗法AMX0035（最初显示出前景，但在更大规模的III期试验中未能证明疗效）。尽管取得了这些进展，现有疗法无法阻止疾病进展，突显了改进实验模型以更好地理解ALS病理生理学和识别有效治疗靶点的迫切需求。
诱导多能干细胞（iPSCs）几年前作为一种强大的疾病建模工具出现，能够在体外生成患者特异性的多能细胞，随后可分化成任何细胞类型。与这一科学突破直接相关，已有超过十几种从iPSCs分化运动神经元的方案发表，导致ALS研究领域使用iPSCs的研究激增，超过600篇出版物。一些综述已讨论了使用iPSC来源的运动神经元建模ALS，最近的文章也总结了基于iPSC的ALS研究结果。然而，这些文章发表于近5年前，由于iPSC模型的使用在过去几年中激增，需要更新的综述。此外，大多数综述大规模讨论ALS建模，并转录了来自所有ALS致病基因和散发病例的结果，这使得结果整合变得极其困难。在此背景下，研究人员希望通过聚焦于一个特定基因——TARDBP，来更新ALS建模的文献综述。TARDBP编码TAR DNA结合蛋白43（TDP-43），一种RNA和DNA结合蛋白。
约2%–5%的家族性ALS（fALS）和1.5%的散发病例携带TARDBP基因突变。TDP-43通常定位于细胞核，在RNA代谢中发挥关键作用。然而，作为ALS疾病的后果，TDP-43在几乎所有ALS患者（约97%）的退行性运动神经元中变得过度磷酸化、被切割成片段并聚集成包涵体。TDP-43病理也是许多额颞叶痴呆（FTD）病例的标志，支持ALS和FTD代表神经退行性疾病谱系的概念。鉴于TDP-43在ALS中的关键作用，理解TARDBP突变如何导致神经退行性变将为TDP-43蛋白病在ALS运动神经元变性中的作用提供重要见解。
在此背景下，研究人员选取了自2012年以来发表的36项研究，这些研究聚焦于表征iPSC来源的运动神经元中与TARDBP突变相关的ALS表型。这些研究报告了各种细胞改变；然而，研究结果存在相当大的变异性，使得就该模型在重现ALS病理方面的可靠性得出明确结论变得具有挑战性。分化方案、运动神经元的纯度和年龄以及量化方法等因素都可能造成这些不一致。因此，对现有数据进行系统综述对于评估该模型在ALS研究中的稳健性和可重复性，以及更具体地用于药物筛选至关重要。
在这项系统综述中，研究人员旨在详细总结所有研究来自TARDBP突变ALS患者的iPSC来源运动神经元的已发表研究。为了聚焦于疾病相关模型，研究人员排除了在iPSC中过表达、敲低或敲除TDP-43的研究。通过整合多项研究的数据，本综述旨在突出关键发现，识别共性与差异，并提供关于iPSC来源运动神经元作为ALS模型的优势和局限性的见解。研究人员还讨论了所有从TARDBP iPSC系分化的其他细胞类型及其细胞和非细胞自主疾病机制。研究人员的目标是提供关于iPSC在疾病理解和治疗开发方面潜力的更清晰视角，最终推动ALS有效治疗的努力。
纳入标准
本综述纳入的出版物在PubMed中使用以下关键词检索：“iPSC”、“TDP43”、“TARDBP”、“MNs”。在自2012年以来发表的60多篇论文中，研究人员纳入了36篇研究，这些研究涉及来自携带TARDBP突变的ALS患者的iPSCs，或经编辑携带TARDBP基因突变的对照iPSC系。研究人员排除了在iPSC中过表达或敲低TDP43的研究，以聚焦于更疾病相关的模型。虽然研究人员旨在通过定义的检索策略捕获所有相关研究，但有可能一些出版物未被检索到或不符合纳入标准。
正文
将iPSCs分化为运动神经元：协议繁多
最早的体外生成运动神经元的方案使用小鼠胚胎干细胞，为后来从人类iPSCs发展的分化方案奠定了基础。在人类发育过程中，运动神经元在特定时间点由特定因子激活的特定信号通路调控下生成。这种高度协调的信号机制已在两栖动物、鸡和小鼠胚胎中得到广泛研究。已开发出在体外重现运动神经元生成的方案，要么通过向iPSCs施用小分子，要么通过直接激活靶向转录因子。在本综述纳入的36项研究中，34项使用小分子定向分化，仅2项使用转录因子定向分化。
小分子定向分化方案
自2008年以来，已有超过20种方案使用小分子指导iPSCs分化为运动神经元。尽管它们通常遵循三个核心发育步骤——神经化、腹侧化和头尾模式化，但可细分为两种概念上不同的策略。早期基于小分子的方案主要依赖维甲酸和SHH激动剂诱导脊髓运动神经元身份。这些策略重现了腹侧神经管模式化的某些方面，但主要产生吻侧（颈部或前臂）身份的运动神经元。相比之下，后来由Maury等人和Du等人提出的方案纳入了一个由WNT信号诱导的中间轴向或神经中胚层祖细胞样（NMP样）阶段。通过首先生成WNT响应的轴向样祖细胞，然后调节维甲酸暴露的时间，这些方案允许在神经承诺之前对HOX激活进行受控进展，从而能够指定臂、胸或更尾侧的运动神经元身份。这一转变不仅代表技术上的改进，更代表着在体外重现躯干发育动力学的概念性进步。
在本综述纳入的研究中，大多数方案改编自这两个发育框架之一。在实践中，作者通常引用先前建立的方案作为概念基础，然后引入实验室特定修改，包括因子浓度、时间、培养格式或成熟条件的调整（表1）。因此，虽然潜在的发育逻辑通常追溯到有限的参考方案，但各研究之间存在巨大的方法学变异性。在以下章节中，研究人员逐步描述分化过程，突出可能有助于运动神经元身份、成熟状态和实验结果的信号因子差异。
大多数运动神经元分化方案的一个常见早期步骤是从iPSCs诱导神经外胚层命运。在胚胎发育过程中，神经板的形成需要抑制TGF-β和BMP信号，防止中胚层和内胚层特化并促进神经身份。在体外，这通常通过使用SB431542抑制TGF-β信号和使用Dorsomorphin或其更特异的类似物LDN193189抑制BMP信号来实现，该策略通常称为双重SMAD抑制。在本综述纳入的研究中，11项研究使用SB431542+Dorsomorphin进行双重SMAD抑制，9项研究使用SB431542+LDN193189（表1）。尽管研究表明LDN193189对BMP受体的特异性高于Dorsomorphin，但该因子仍用于最近的论文中以诱导iPSCs的神经诱导。
神经诱导后，通过激活Sonic Hedgehog（SHH）信号实现腹侧化，该信号指定腹侧神经管身份并诱导运动神经元祖细胞标志物如OLIG2的表达。在体外，这通过使用SHH本身或小分子激动剂如Smoothened激动剂（SAG）和Purmorphamine（PMA）单独或组合实现。在综述的论文中，仅3项研究使用SHH本身，5篇论文使用SAG，11篇论文使用PMA，5篇论文使用SAG和PMA的组合。
头尾特化随后通过调节WNT和维甲酸信号建立。CHIR-99021（CHIR）是一种激活经典WNT信号的GSK3抑制剂，通常与维甲酸联合使用以促进后部身份并赋予脊髓特征。在纳入的研究中，9种方案单独使用维甲酸，通常遵循更经典的模式化方法。相比之下，大多数方案将维甲酸和CHIR结合，反映了在运动神经元特化之前纳入WNT响应的轴向或神经中胚层祖细胞样阶段的策略，从而允许更受控的尾侧化和HOX基因激活动态调节。
所有运动神经元分化方案的最后一步是成熟。在体外，这首先通过使用神经营养生长因子处理获得，这些因子促进神经突生长和神经元存活，如BDNF（脑源性神经营养因子）、GDNF（胶质细胞源性神经营养因子）、CNTF（睫状神经营养因子）和IGF-1（胰岛素样生长因子1）。其次，成熟也通过抑制NOTCH信号获得，NOTCH信号促进神经祖细胞增殖，使用如DAPT和化合物E等因子。在此步骤中，各研究之间成熟鸡尾酒疗法的组成和持续时间存在相当大的变异性。
尽管在用于分化运动神经元的小分子上似乎存在共识，但这些因子的组合、浓度和时间存在显著异质性。研究人员在本综述纳入的36项研究中识别出超过27种不同的参考方案，大多数实验室引入方案特异性修改。重要的是，分化持续时间也显著变化。为解决这种变异性，研究人员在表1中区分了（1）有丝分裂后运动神经元特化的日期和（2）进行实验的日期。在各研究中，有丝分裂后特化发生在大约第10天到第35天之间，而分析在培养中约20天到超过70天的任何时间进行。这一广泛的时间窗口可能不仅反映了成熟状态的差异，也反映了所衍生运动神经元在体外“老化”程度的差异。由于神经元成熟度影响电生理特性和代谢谱等参数，培养持续时间的差异可能显著导致各研究报告的表型严重程度差异。
此外，本综述纳入的大多数研究对其引用的方案进行了自己的修改，进一步增加了异质性。人们可能期望，随着时间推移，产生最高运动神经元纯度和可重复性的方案将在各实验室中标准化。相反，由于有多种有效的方法可诱导运动神经元命运，大多数实验室倾向于采用和调整最适合其技术环境、所需产量、实验时间线和本地专业知识的方案。
转录因子定向的运动神经元分化
在发育过程中，信号因子下游导致直接负责运动神经元分化和特化的转录因子激活。基于小分子的方案旨在重现这些发育信号级联，从而模拟胚胎模式化事件。然而，由于转录因子是谱系特化的最终效应物，直接表达这些因子可能足以诱导运动神经元身份，并可能减少小分子方法有时观察到的运动神经元产量的变异性和异质性。
重要的是，转录因子定向策略并非旨在取代发育模式化方法，而是代表一种具有独特优势的替代方法，包括更短的分化时间线和增加的细胞同质性。然而，强制过表达不能完全重现内源性发育动态，可能引入基因调控的人工方面。
在本综述中，仅2项研究优先使用转录因子定向的运动神经元分化。这一有限数量可能反映了这些方案的额外技术要求，涉及在iPSC阶段遗传整合转录因子构建体或将病毒递送至神经祖细胞。在Onda-Ohto等人的研究中，将表达NGN2、ISL1和LHX3的腺病毒载体添加到iPSC来源的神经祖细胞中，所得群体中约50%的运动神经元纯度。在Held等人的研究中，使用带有相同三个四环素诱导转录因子（NGN2、ISL1和LHX3）的PiggyBac质粒直接在iPSC阶段整合，分化13天后，这导致非常高的运动神经元群体纯度，超过95%的细胞表达运动神经元特异性标志物。
iPSC来源运动神经元的纯度
为确定所得运动神经元群体的纯度，大多数已发表研究常规使用免疫细胞化学量化iPSC来源运动神经元上的不同运动神经元标志物。Tuj1标记β-III微管蛋白，MAP2（微管相关蛋白2）通常用作通用神经元标志物以鉴定所得群体的神经元命运。为更特异地鉴定运动神经元身份，使用三个主要标志物：Islet（ISL1/ISL2——Islet LIM Homeobox 1/2）作为早期运动神经元标志物；ChAT（胆碱乙酰转移酶）作为功能性胆碱能运动神经元的标志物；HB9（MNX1——运动神经元和胰腺Homeobox 1）作为成熟运动神经元的标志物。NF抗体也常用，包括SMI-32（标记非磷酸化神经丝-H）和SMI-312（识别磷酸化NF表位），用于鉴定大型投射神经元，包括运动神经元，但并非运动神经元所独有。
尽管这些标志物被广泛使用，但抗体特异性、克隆选择和染色方案在各实验室间存在差异，可能影响标志物检测和量化。例如，HB9/MNX1是发育过程中运动神经元特化和维持所需的确立转录因子。然而，其表达可受发育调控且具有背景依赖性。因此，HB9水平可能取决于神经元的成熟阶段和培养条件，当作为唯一标志物使用时可能导致运动神经元纯度的低估或高估。这种阶段依赖性表达使使用不同分化时间线或不同分析时间点的研究之间的HB9阳性百分比直接比较复杂化。
尽管标志物选择和检测方法存在变异性，但可以识别出哪些方案实现了最高报告的运动神经元纯度的一般趋势。Held等人的方案似乎是最有效的之一，使用转录因子定向分化在短短13天内产生>95%的纯运动神经元。使用小分子定向分化，Lefebvre-Omar等人和Lépine等人也实现了非常高的纯度。
由于在ALS中，不同的运动神经元亚型对疾病发生和进展表现出不同程度的易感性，例如眼运动神经元在整个疾病进展过程中保持相对抵抗，因此定义当前分化方案生成哪些运动神经元亚型至关重要。重要的是，上运动神经元（脑中）和下躯体运动神经元在ALS中均发生变性。然而，本综述讨论的方案仅专注于生成下运动神经元。这反映了当前在体外生成特定上运动神经元亚类的技术挑战。
转录组学分析的出现现在允许研究人员更好地表征从iPSCs生成的特定运动神经元亚型。Lefebvre-Omar等人使用转录组学确认其方案产生颈段胆碱能骨骼运动神经元，通过ISLET1（ISL1）和HB9（MNX1）的表达确认，而胆碱能运动神经元身份通过ACHE（乙酰胆碱酯酶）和VACHT（囊泡乙酰胆碱转运体）的表达支持。重要的是，他们进一步证明这些神经元主要对应于α运动神经元，基于RBFOX3（RNA结合fox-1同源物3）、SV2B（突触囊泡糖蛋白2B）和STK32A（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶32A）的差异表达与γ运动神经元区分。作者建议这些运动神经元可能特异性支配肢体肌肉，验证了其用于ALS建模的用途。类似地，Ziff等人整合了18项iPSC来源运动神经元研究的转录组数据，包括两项涉及TARDBP患者来源细胞的研究，发现所有方案主要生成后脑、颈和胸运动神经元，而非腰或骶运动神经元。这些发现表明当前分化方案倾向于生成颈运动神经元，突显了在支配下肢肌肉的神经元中建模ALS的能力差距。
TARDBP突变纳入iPSC建模研究
已在TARDBP上鉴定出超过40种不同的错义突变，其中大多数是致病的。这些突变被认为导致fALS，但也已在无家族史的散发性ALS（sALS）患者中鉴定到。TARDBP突变携带者约占家族性病例的2%至5%和sALS病例的1.5%。TARDBP突变大规模聚集在基因的C端区域，该区域编码TDP-43蛋白的甘氨酸丰富结构域，已知参与蛋白质-蛋白质相互作用。患者中最常见的TDP-43 ALS变异体是A382T、M337V和G348C，其中两种已通过iPSC建模得到深入研究。M337V-iPSC系是TDP-43-iPSC建模领域研究最多的细胞系。该细胞系也是第一个被分化为运动神经元并进行表征的细胞系（图1）。
图1
TARDBP的结构域组织及其突变在iPSC来源运动神经元研究中的代表性。a 人类TARDBP基因（414个氨基酸）的线性示意图，显示核定位信号（NLS）、RNA识别基序（RRM1和RRM2）以及C端甘氨酸丰富/低复杂度结构域（GRD/LCD）。本综述讨论的ALS相关TARDBP突变映射到其各自的氨基酸位置。大多数突变聚集在C端甘氨酸丰富结构域内。突出显示了常被研究的突变。b 在本综述纳入的34篇出版物中，每种突变在iPSC来源运动神经元中被建模的独立研究数量。
TARDBP iPSC运动神经元的表型
TARDBP突变iPSC运动神经元的形态
理解ALS病理生理学面临的挑战在于退行性运动神经元位于患者的大脑和脊髓中，使得在疾病进展期间无法对其进行研究。分析死后组织有助于阐明变性和疾病的途径；然而，在此阶段只能表征剩余的运动神经元。因此，没有关于ALS患者疾病早期发展期间运动神经元形态和特征的信息。来自ALS患者的iPSC来源运动神经元为研究ALS发病机制的最早阶段（在致命变性之前）提供了宝贵工具。
关于iPSC来源运动神经元的总体形态，Kreiter等人报告TARDBP运动神经元与对照运动神经元相比，表现出更高百分比的珠状和断裂神经突。类似地，Fujimori等人报告TARDBP运动神经元中神经突肿胀的百分比增加。相反，其他研究报告TARDBP运动神经元的形态未改变；然而，他们在没有量化的情况下得出这一结论（Zhang等人；Onda-Ohto等人）或通过量化其他参数如每个神经元的神经突数量（Zhang等人）（表2）。
更仔细地关注来自TARDBP ALS患者的运动神经元的神经突长度，只有三项研究报告了改变。Egawa等人显示HB9-GFP表达的TARDBP运动神经元与对照相比神经突长度减少。Fujimori等人报告直到第40天神经突长度与对照相似；此后在TARDBP运动神经元中减少，但在对照系中未减少。Mitsuzawa等人研究了未解离运动神经元胚体边缘的神经突长度，TARDBP运动神经元显示神经突长度减少，但轴突分支增加（表2）。有趣的是，这种运动神经元表型已在其他TDP-43体内模型中观察到。在斑马鱼幼虫中过表达TDP-43突变导致运动神经元轴突长度减少但轴突分支增加。在鸡胚中过表达TDP-43突变时观察到类似结果。然而，在最近一项使用iPSC来源运动神经元的研究中，Lépine等人报告轴突面积和轴突分支在对照系和两个TARDBP突变系之间相似。
总之，36项研究中只有少数检测到与神经突形态和长度相关的形态学变化。重要的是，在某些研究中检测到的神经突长度减少与神经突肿胀相关，似乎与TARDBP患者运动神经元在培养中的总体细胞死亡密切相关。综合来看，各研究和量化方法之间的差异表明该表型是可变的，并受运动神经元延伸神经突的条件强烈影响。要就潜在改变达成明确结论，未来工作应使用微流控装置在标准化、可重复的背景下评估这些参数。
TARDBP突变iPSC来源运动神经元的细胞死亡和变性
来自ALS患者的iPSC来源运动神经元能够确定可能驱动其变性的运动神经元的细胞自主内在特征。以下段落总结了TARDBP患者来源运动神经元基线活力的研究，以评估TARDBP突变是否足以引起运动神经元变性（表3）。
一些研究报告TARDBP运动神经元与对照系相比活力降低。在Bilican等人的研究中，使用自动荧光显微镜跟踪HB9-GFP转染细胞的荧光损失，揭示TARDBP运动神经元与对照相比活力降低。在Fujimori等人和Yu等人的研究中，TARDBP系与对照相比向细胞外培养基释放的乳酸脱氢酶（LDH）增加，表明细胞毒性，更具体地说是细胞膜完整性丧失。此外，Fujimori等人报告TARDBP运动神经元中切割的caspase-3染色增加，表明TARDBP运动神经元的损失与凋亡途径有关。
相反，其他研究发现TARDBP运动神经元的活力没有影响。在Egawa等人的研究中，LDH泄漏试验显示对照和TARDBP运动神经元之间没有差异。Devlin等人使用多种技术在铺板后监测基线条件下的活力长达10周；细胞计数、LDH泄漏和固缩核量化均显示TARDBP患者运动神经元与对照之间没有差异。Seminary等人通过计数细胞在分化后3周和4周测量活力，同样检测到TDP-43和对照运动神经元之间没有差异。在Lépine等人的研究中，基于ATP的活力试验在6周监测期间显示TARDBP突变系和对照系之间没有差异。值得注意的是，当iPSC来源运动神经元在没有神经营养因子的情况下培养时，活力随培养时间显著下降；然而，即使在这些条件下，患者和对照运动神经元之间也没有差异。
有趣的是，Kreiter等人通过LDH释放或核计数发现突变和对照运动神经元之间没有差异，并检测到无DNA损伤或双链断裂的迹象。相反，同一研究基于固缩核计数报告TARDBP系的总细胞死亡增加，但该效应是突变特异性的：在TDP-43 G294V系中观察到，但在S393L系中未观察到（表3）。
总体而言，关于TARDBP运动神经元的体外基线活力没有共识。研究人员试图将观察到的差异与研究的具体TARDBP突变、运动神经元纯度、基质涂层、成熟/老化时间和量化方法的差异联系起来，但未找到明确解释。例如，Bilican等人和Seminary等人尽管使用相同的TARDBP M337V iPSC系，但报告了不同的活力结果；然而，他们使用了不同的活力量化技术和不同的分化方案来生成运动神经元。对分歧结果的一个可能解释是方法学和背景异质性。这些研究使用了不等效的“活力”读数（LDH泄漏、用于代谢活性的基于ATP的试验、用于凋亡的切割caspase-3和固缩核计数），这些读数捕获了细胞死亡的不同阶段。此外，表型以时间依赖性方式出现（例如Fujimori等人中成熟40天后出现的变化），因此采样窗口的差异可以改变结果。总之，这些因素构成了TARDBP运动神经元基线活力缺乏共识的基础。需要在定义的时间点进行标准化、多参数试验以解决这些差异。
ALS通常是一种迟发性疾病，平均发病年龄从50到65岁不等，中位数为64岁。为什么运动神经元仅在较晚年龄开始变性仍尚待理解。越来越多的证据表明运动神经元对各种细胞应激源特别脆弱，包括氧化应激、内质网应激、兴奋性毒性和蛋白酶体功能障碍。一些研究检查了体外应激条件下TARDBP ALS患者来源运动神经元的活力（表4）。与基线状态存在一些争论不同，文献的这一方面更为一致，TARDBP运动神经元与对照系相比一致地表现出对应激的易感性增加。
在Bilican等人的研究中，LDH试验显示MAPK抑制（U0126）和内质网应激（衣霉素）在各系中引起类似的死亡，而PI3K抑制（LY294002）比对照更显著地降低了TARDBP运动神经元的活力。Zhang等人通过MTT观察到氧化应激（亚砷酸钠、tBOOH、山梨醇）无组间差异，但TARDBP运动神经元在星形孢菌素诱导的凋亡后表现出更大的死亡。Egawa等人通过EthD-1量化，报告急性亚砷酸钠暴露后TARDBP运动神经元的活力降低。一致地，Onda-Ohto等人发现仅1.5小时过氧化氢处理后切割caspase-3显著增加。额外的研究加强了这种高度易感性：Sun等人显示蛋白酶体抑制（MG132）后通过LDH和切割caspase-3过早死亡；Dafinca等人和Watts等人报告毒胡萝卜素诱导的内质网应激后活力降低，Watts等人也用衣霉素确认了该效应；Lépine等人证明谷氨酸诱导的兴奋性毒性后死亡率增加，而依他尼酸诱导的氧化应激仅在两个TARDBP系之一增加死亡率。
综合来看，令人惊讶的是所有研究都确定了TARDBP运动神经元对应激的敏感性增加，即使具体触发因素不同。这些差异很可能来自每种应激物的浓度和暴露范式（例如急性与延长处理以及测量时间），这些可以启动不同的应激反应程序。此外，用于量化损伤的试验（LDH释放、ATP、EthD-1标记、切割caspase-3）捕获了损伤的不同阶段并在敏感性上有所不同，进一步导致不同的读数。标准化应激物浓度和暴露窗口，并采用协调的多参数读数，应有助于调和这些差异。尽管如此，TARDBP突变运动神经元对应激的敏感性增加在各研究中一致观察到，将其确立为稳健的体外表型读数。
电生理水平的功能
在体外研究TARDBP运动神经元来源的iPSC运动神经元的电生理学对于理解ALS机制至关重要，因为在人类患者和ALS动物模型中都观察到了早期功能变化。体内研究表明运动神经元过度兴奋，通常与钠电流改变有关，甚至在症状出现之前就发生；然而，这些研究大多在SOD1小鼠模型上进行。来自TARDBP患者的iPSC来源运动神经元为在人类背景下研究这些早期破坏提供了宝贵工具，并且与TDP-43-ALS特别相关（表5）。
使用多电极阵列记录，Lépine等人观察到TARDBP运动神经元随时间的自发神经元活动进行性丧失，反映在平均放电率下降和活动电极减少，而剩余活动电极中的爆发特性保持不变。类似地，Smith等人报告爆发减少但爆发持续时间增加，平均放电率总体增加，表明网络活动改变。
钙成像研究进一步揭示了Ca2?稳态的破坏。Bursch等人发现TARDBP运动神经元中基础细胞内Ca2?水平升高，自发Ca2?瞬变无差异；然而，AMPA受体刺激引发了显著更高的Ca2?瞬变幅度，尽管AMPA受体亚基表达不变。相反，Dafinca等人报告去极化后Ca2?幅度降低，KCl处理后恢复时间延长，谷氨酸刺激后峰值幅度增加且恢复延迟。用美金刚阻断NMDA受体导致TARDBP运动神经元中Ca2?水平升高，支持谷氨酸驱动的过度兴奋的概念。
膜片钳研究为TARDBP运动神经元功能障碍提供了额外见解。Zhang等人观察到自发突触活动减少，突触后电流频率降低但幅度不变。Devlin等人检测到全细胞电容或输入电阻无变化，但TARDBP运动神经元表现出更去极化的静息膜电位、早期过度兴奋，以及随成熟的动作电位输出和突触活动进行性丧失，与钠和钾电流的年龄依赖性减少相关。与此一致，Smith等人报告更去极化的静息膜电位（但仅在一个TARDBP系中）以及随培养时间的重复动作电位发放进行性下降。相反，Kreiter等人和Fazal等人发现无显著电生理改变，钠和钾电流、动作电位产生和突触活动得以维持。
Harley等人提供了兴奋性动态、时间依赖性变化的证据。在发育早期，TARDBP运动神经元表现出轴突起始段（AIS）长度增加、AIS可塑性受损和内在过度兴奋，导致动作电位阈值降低和自发放电增加；这种过度活动与类似于ALS肌束颤动的自发肌纤维收缩相关。随时间推移，这些神经元转变为低兴奋性，其特征为AIS缩短、放电频率降低和动作电位产生受损，与ankyrin-G和电压门控钠通道的失调相关。
总体而言，TARDBP运动神经元的电生理研究揭示了神经元功能复杂的时间依赖性破坏。早期改变表现为兴奋性增加，特别是在膜片钳和钙成像研究中，表现为对刺激的过度反应和细胞内Ca2?信号增加。然而，这种初始过度活动并非普遍观察到，因为一些研究报告钠和钾电流或动作电位特性无显著偏差。随时间推移，TARDBP运动神经元的兴奋性下降，向低兴奋性和突触功能障碍转变。多电极阵列研究突出显示自发性网络活动的进行性丧失，爆发频率和总体神经元输出减少。全细胞膜片钳记录进一步证实了这一转变，显示动作电位产生逐渐丧失和离子通道电导降低。虽然一些研究报告神经元功能保留，但大多数发现支持TARDBP突变导致早期过度活动，随后恶化为低兴奋性，从而促进ALS病理生理学的模型。重要的是，运动神经元在体外的成熟和延长维持也可能影响电生理特性。随着神经元在培养中老化，内在膜特性、突触连接性和网络活动可以独立于疾病突变而变化，这可能有助于各研究观察到的变异性。
该模型是否在体外重现ALS病理？
TDP-43聚集和错误定位
来自ALS患者的iPSC来源运动神经元为评估TARDBP突变是否改变患者细胞中TDP-43基因或蛋白表达提供了疾病相关模型。在mRNA水平（表6），大多数研究报告TARDBP突变和对照运动神经元之间TARDBP/TDP-43转录本丰度相似。只有Egawa等人通过qPCR观察到患者运动神经元系中TARDBP mRNA增加；值得注意的是，同一患者系内存在显著的克隆变异，一些克隆类似于对照，另一些则显示表达升高。
在蛋白质水平（表7），研究检查了总TDP-43以及可溶性和不溶性部分。Seminary等人和Sun等人发现TARDBP突变和对照运动神经元之间总TDP-43蛋白无差异，而Fazal等人报告TARDBP运动神经元中总TDP-43增加。在同一研究中，可溶性全长TDP-43水平不变，但不溶性部分在患者运动神经元中显著增加。重要的是，不溶性部分含有升高水平的C端TDP-43片段（CTF-35 kDa和CTF-25 kDa），这些被认为是与TDP-43聚集相关的病理切割产物。Fazal等人还通过Western blot检测到磷酸化TDP-43（pTDP-43）增加，进一步支持突变运动神经元中存在疾病相关TDP-43种类。
类似地，Bilican等人报告TARDBP患者系中可溶性和不溶性TDP-43水平均增加，而Klim等人发现与对照相比，四个TARDBP突变系的可溶性或不溶性TDP-43水平无差异。重要的是，用于评估TDP-43溶解性的生化方法在各研究中存在差异。虽然一些方案依赖去污剂提取，然后基于尿素的不可溶部分溶解和Western blot分析（例如Bilican等人；Lépine等人），其他方案应用了修改的工作流程，其中不溶性沉淀物被重悬并相对于可溶性部分归一化（Klim等人）。此外，一些研究使用过滤捕集试验而非经典的可溶性/不溶性Western blot分级来评估去污剂抗性TDP-43聚集体（Seminary等人）。这些方法学差异可能影响检测可溶性或聚集TDP-43种类的敏感性，在比较各研究结果时应予以考虑。
总之，TARDBP突变似乎不会改变患者来源运动神经元中mRNA水平的基因表达，表明TDP-43自调控没有受损。在蛋白质水平，各研究结果更可变；然而，一些报告表明不溶性TDP-43种类增加。值得注意的是，只有一项研究（Fazal等人）直接通过Western blot量化了pTDP-43，突显了这一关键病理标志在iPSC来源TARDBP运动神经元模型中仍然很大程度上未被探索。
在ALS中，细胞质TDP-43包涵体是98%患者的病理标志。一个主要焦点是理解主要核蛋白如何在细胞质包涵体中积累。来自携带TARDBP突变的ALS患者的运动神经元提供了相关系统来测试TARDBP突变是否单独能在体外驱动TDP-43错误定位（表8）。在此背景下，16项研究使用免疫荧光检查了TARDBP患者来源运动神经元中TDP-43的亚细胞分布。
超过一半的研究得出结论，在来自TARDBP突变患者的运动神经元中不存在TDP-43的细胞质错误定位。在Zhang等人和Bossolasco等人的研究中，对照和TARDBP系中具有细胞质TDP-43的神经元百分比为2%至3%。在Seminary等人的研究中，培养中约40%的运动神经元具有细胞质TDP-43阳性斑点，但任何ALS iPSC系与对照相比，具有细胞质TDP-43+斑点的神经元比例或每个神经元的斑点数量均无显著差异。Klim等人量化TDP-43核质比在对照和TARDBP突变运动神经元中均约为80%，表明所有系中主要定位于核。Lépine等人同样通过免疫细胞化学和分级发现核/细胞质TDP-43无差异。Kreiter等人、Ratti等人和Onda-Ohto等人得出相同结论，即定位未改变且无聚集，尽管没有量化。
相反，其他研究报告了明确的细胞质错误定位和/或聚集。Fazal等人观察到患者系中TDP-43核/细胞质比率降低，并通过分级和免疫印迹证实TARDBP运动神经元中细胞质（但核不变）TDP-43更高。类似地，Smith等人通过免疫荧光报告细胞质TDP-43强度增加。Egawa等人检测到TARDBP运动神经元中每个细胞的细胞质TDP-43聚集体数量与对照相比略有增加。Lefebvre-Omar等人注意到TARDBP运动神经元中非常罕见的核TDP-43斑点，但对照中没有，没有量化。值得注意的是，
