## 中文标题 沿海区域角毛藻际（The Chaetocerosphere）：角毛藻属（*Chaetoceros*）物种与其相关原核生物的关联研究

《Environmental Microbiology Reports》：The Chaetocerosphere: Chaetoceros Species and Associated Prokaryotes in a Coastal Area

　　

## 摘要专业翻译

藻际（phycosphere）是围绕浮游植物细胞的富含有机物的微环境，介导着藻类与其他微生物（主要为原核生物）之间的相互作用。本研究调查了沿海水域中最丰富的硅藻属之一——角毛藻属（*Chaetoceros*）与附着颗粒的原核生物群落之间的关联。研究人员于2017年10月至2018年9月在那不勒斯湾（Gulf of Naples，意大利）的一个固定观测站进行了月度样品采集。将角毛藻属的光学显微镜（light microscopy, LM）计数结果与16S rRNA基因宏条形码（metabarcoding）数据相整合，并应用二分网络分析（bipartite network analysis）来推断推定的物种特异性关联。大多数推断出的关联涉及此前已有报道的与硅藻相关的类群，如α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes），以及包括热原体纲（Thermoplasmata）和海洋类群II（Marine Group II）在内的古菌类群。网络分析结果同时包含单一和（2–3个）成组的角毛藻属物种。值得注意的是，所涉及的物种大多为链状形成种类，尽管该特征在塑造原核生物关联中的功能作用仍不明确。总体而言，本研究结果拓展了可能与角毛藻属相关的原核生物类群范围，并揭示了近岸海洋生态系统中新的跨域（interkingdom）互作可能性。

## 论文解读文章

### 一、研究背景与科学问题

硅藻（Bacillariophyta）是单细胞光合真核生物，属于浮游植物的主要谱系之一，在水生环境中贡献了高达50%的全球初级生产力。硅藻的生态成功除归因于其独特的形态生理特征（如大型中央液泡、硅质外壳和生化防御机制）外，越来越多的证据表明跨域伙伴关系也协助硅藻在海洋不利环境中生存。海洋硅藻通过化学交换在细胞周围的扩散区域（即藻际，phycosphere）释放多种有机和无机化合物，与原核生物相互作用并影响其生长和功能。原核生物则演化出游动性、趋化性以及细胞表面附着机制，以维持与藻际的密切联系，支持从协同到拮抗的多种生物互作。

在海洋硅藻和浮游植物的藻际中，最常见到的原核生物属于变形菌门（Proteobacteria，如玫瑰杆菌属 *Roseobacter* 和球硫杆菌属 *Sulfitobacter*）和拟杆菌门（Bacteroidetes，如噬胞菌属 *Cytophaga* 和黄杆菌属 *Flavobacterium*）。在培养条件下，这些原核生物已被证明可为硅藻提供维生素B₁₂、生物可利用铁甚至氮。然而，同属类群中的某些分类单元能够产生杀藻化合物，可能杀死硅藻；一些硅藻也能产生抗菌化合物作为防御特征。此外，不同硅藻物种或同一物种在不同生理状态下会为不同的原核生物关联形成独特的生态位，而某些原核生物能够根据环境条件将相互作用类型由共存转变为致病性。在海洋水华期间，通常有益的细菌在水华末期可转变为致病性，产生溶解浮游植物的杀藻化合物，导致有机碳释放到环境中。硅藻-原核生物互作在海洋生态功能之外，还在海洋生物技术领域具有应用价值，如废水修复、水产养殖、温室气体减排、生物质和生物燃料生产等。

角毛藻属（*Chaetoceros*）是一个全球分布、物种丰富的硅藻属，占据多种生态位，包含能够形成链状、产生毒素和形成休眠阶段的物种。该属分类学研究较为完善，已描述228个物种，并与多种微生物（包括附生原核生物、固氮蓝藻、砂壳纤毛虫等）存在关联。然而，硅藻-原核生物互作在野外和实验室条件下都难以研究。培养实验中可通过菌株分离或其他方法研究，而高通量测序（High-Throughput Sequencing, HTS）是详述宿主和相关原核生物的有力工具。尽管HTS广泛采用，光学显微镜（LM）仍是硅藻鉴定的稳健且传统的方法，其可靠的形态学分辨率尚未被HTS方法完全匹配。在数据分析方面，跨域类群间的互作、共存和依赖性引入了多维性和更高的复杂性，可通过网络分析解决。其中二分网络分析已被证明可用于探索属于不同类群（如两个微生物界）节点间的相互作用，优于将所有节点（物种）等同分类的单分网络。

本研究旨在描述意大利那不勒斯湾沿岸站点的角毛藻属物种与原核生物在一年内的关联，重点聚焦于2018年春季藻华期。具体研究目标包括探索角毛藻属在微生物组招募中的可能作用，以及环境原核生物在塑造硅藻-原核生物关联中的影响。

### 二、研究内容与方法概述

研究以那不勒斯湾的长期生态研究站MareChiara（LTER-MC，40°48.5′N，14°15′E）为采样点，该站位于中营养沿海区域与寡营养第勒尼安海中部水域的交界处。2017年10月至2018年9月期间每月采集表层样品（2018年6月除外），在春季水华期间（2018年4–5月）加密至每10天采样一次。每个采样事件中，使用SBE 19plus CTD获取温度、盐度、深度、溶解氧浓度和荧光剖面；叶绿素a（Chl a）和褐藻素（Phaeo）依据Holm-Hansen等方法测定。浮游植物样品（500 mL）用缓冲甲醛固定，依据Uterm?hl方法在Zeiss Axiovert 200倒置显微镜下进行物种鉴定和计数。用于DNA提取的样品用20 μm孔径浮游生物网水平拖网采集，将20 mL浓缩样品过滤到3.0 μm滤膜上以保留附着颗粒的原核生物（主要附着于硅藻）。DNA提取使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit。16S rRNA基因的V4-V5高变区使用515F-Y和926R引物对扩增，在Illumina MiSeq平台（2 × 300 bp双端测序）上完成测序。原始序列已提交至NCBI SRA数据库（BioProject #PRJNA1338595）。生物信息学分析流程包括Trimmomatic质控、QIIME2流程中的DADA2算法生成扩增子序列变体（ASVs），以及基于SILVA数据库v138.2的朴素贝叶斯分类器进行物种注释。去除注释为叶绿体、线粒体或未知的ASV。数据分析使用phyloseq和ggplot2 R包；BIO-ENV分析用于探索环境变量与ASV数据集之间的关系；二分网络使用Cytoscape软件中的CoNet应用程序构建，以Pearson、Spearman和Bray-Curtis作为推断度量组合以减少假阳性，仅保留两个分区（角毛藻属物种与古菌/细菌ASV）之间的正关联边。

### 三、主要研究结果

**3.1 角毛藻属物种组成与动态**

硅藻始终是样品中最丰富的浮游植物类群，角毛藻属在几乎所有采样日期中都是最具代表性的硅藻。在春季水华期间（4月至5月），角毛藻属的丰度占比超过90%。全年共鉴定出20种角毛藻属物种（除未定种 *C.* spp. 外均鉴定至物种水平）。大多数物种的浓度峰值出现在4月12日，总丰度达2.0 × 10⁷ cell L^-1，其中 *Chaetoceros tenuissimus*（单细胞形态）占总数的63%。4月17日该物种同一形态占80%，但角毛藻总丰度低一个数量级。某些物种（如 *C. decipiens*、*C. diadema*、*C. pseudocurvisetus*、*C. protuberans* 和 *C. throndseni*）仅在冬末（1月/3月）出现，而 *C. simplex* 在夏末（2017年10月和2018年7月/8月）出现。*C. socialis* 在7月出现次级峰值。

**3.2 原核生物群落组成**

测序共获得87,112条原始读段，对应623个ASVs，标准化后为605个ASVs，代表46,335条读段。在门水平上，总数据集以变形菌门（57%）、厚壁菌门（Firmicutes，14%）、拟杆菌门（13%）和异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus，11%）为主。秋季变形菌门平均占80%；冬季和春季其贡献始终高于50%，但拟杆菌门、厚壁菌门和异常球菌-栖热菌门也有贡献；夏季变形菌门贡献最低（40%），而拟杆菌门、厚壁菌门和异常球菌-栖热菌门比例最高。放线菌门（Actinobacteria）在春季出现并在夏季显著增加，秋季和冬季则完全不存在。在科水平上，最丰富的类群为鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae，α-变形菌纲）、芽孢杆菌科（Bacillaceae，厚壁菌门）、栖热菌科（Thermaceae）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）和红环菌科（Rhodocyclaceae，γ-变形菌纲），分别占总ASVs的17%、13%、10%、10%和9%。鞘脂单胞菌科在所有季节中都是最丰富的科，夏季除外（此时最丰富的是芽孢杆菌科，占19%）。

**3.3 二分网络分析**

排除读段数少于5的ASV后，输入表包含442个原核生物ASVs和20种角毛藻属物种。网络推断识别出6个不同的网络，涉及10种角毛藻属物种（占总物种数的50%）和118个原核生物ASVs（占总ASVs的27%）。其中3个网络显示原核生物ASVs仅与单一角毛藻属物种（*C. simplex*、*C. vixvisibilis* 和 *C. tenuissimus* 的群体形态）存在专属关联；另外3个网络显示原核生物ASVs与两种（*C. curvisetus* + *C.* single-sp1；*C. pseudocurvisetus* + *C. diadema*）或三种角毛藻属物种（*C. protuberans* + *C. decipiens* + *C. affinis*）共享关联。在门水平上，变形菌门（主要为α-变形菌纲）和拟杆菌门在网络中占主导地位，与所有角毛藻属物种相关联；厚壁菌门与除 *C. tenuissimus* 和 *C. simplex* 外的所有物种共存；放线菌门与除 *C. affinis*、*C. decipiens* 和 *C. protuberans* 外的所有物种共存。异常球菌-栖热菌门仅与4种角毛藻属物种共存；螺旋体门（Spirochaetes）和浮霉菌门（Planctomycetes）仅与3种共存；广古菌门（Euryarchaeota）与另3种（*C. vixvisibilis*、*C. tenuissimus* 和 *C. simplex*）共存。某些门仅包含与特定角毛藻属物种相关的一个ASV，如候选门WPS仅与 *C. simplex* 连接、蓝藻门（Cyanobacteria）仅与 *C. pseudocurvisetus* 连接、候选门FBP与 *C. vixvisibilis* 连接、Dadabacteria仅与 *C. simplex* 连接。在属水平上，网络识别出48个不同的属。鞘脂单胞菌属（*Sphingomonas*）和鞘脂杆菌属（*Sphingobium*）、甲基杆菌属（*Methylobacterium*）和短波单胞菌属（*Brevundimonas*，均为α-变形菌纲）包含的ASV数量最多（分别为6、4、5、4个）。其他代表性属包括 *Dyadobacter*（4个ASVs）和 *Ekhidna*（4个ASVs）（拟杆菌门）以及异常球菌属（*Deinococcus*，4个ASVs）。

**3.4 原核生物群落与环境因子的关系**

对总ASV数据集，BIO-ENV分析识别出温度和盐度是与群落结构关联最佳的环境变量，但相关性较弱（Spearman's ρ = 0.093）。在与角毛藻属网络相关的ASV子集中，盐度和叶绿素是与网络结构关联最佳的变量，但相关性同样较弱（Spearman's ρ = 0.143）。

### 四、讨论与结论

**讨论部分总结：**

研究人员整合了光学显微镜形态学鉴定与16S rRNA基因宏条形码两种方法，尽管这两种方法各有方法论偏差，但考虑到原核生物大多无法培养或形态学区分而需要HTS，而硅藻的形态学鉴定可避免分子偏差（如DNA提取效率差异、基因拷贝数变异和不完整参考数据库），该双方法路径是合理的。BIO-ENV分析的低相关系数表明，除环境变量外，生物互作和宿主特异性过程可能对硅藻相关原核生物群落的组装有重要贡献。叶绿素被保留在与网络相关ASVs的最佳变量子集中而未用于总群落，暗示浮游植物动态可能有助于塑造与角毛藻属相关的原核生物群落，支持宿主相关过程可影响藻际微生物组招募的假说。

从方法学角度看，本研究结果验证了二分网络分析在此类研究中的适用性。原核生物分类学分辨率受限于扩增子长度（300 bp）和参考序列缺失，仅32%的ASVs可注释至物种水平，但89%可匹配到环境序列并识别至属水平。研究结果支持宿主存在控制机制的假说，因为每种角毛藻属物种都观察到不同的关联和细菌ASV组合。值得注意的是，大多数参与微生物关联的角毛藻属物种为链状形成种类，提示该特征可能在支持关联中发挥作用，但链状形成的功能角色仍需进一步研究。α-变形菌纲和拟杆菌门是与角毛藻属相关的主要门类，但意外的是未发现与玫瑰杆菌枝系（Roseobacter clade）相关的ASVs。在较低分类水平上，特定属如 *Sphingobium* 和 *Sphingomonas*（鞘脂单胞菌科）、*Methylobacterium*、*Brevundimonas* 和 *Paracoccus* 等的关联揭示了选择性互作的存在。古菌类群中，热原体纲和海洋类群II（MG-II）与三种角毛藻属物种相关联。固氮蓝藻较为稀少，仅 *C. pseudocurvisetus* 与一株归属于固氮属 *Pleurocapsa* 的蓝藻ASV关联。此外，网络中还包括一些与淡水或陆地环境相关的原核生物，可能反映了那不勒斯湾沿岸的陆源和淡水输入。

**研究结论翻译：**

本研究提供了海洋沿岸区域跨季节的角毛藻属（*Chaetoceros* spp.）藻际中潜在相关原核生物类群的全面概述。尽管网络分析的推断结果需谨慎解读，但研究结果凸显了宿主和附着原核生物的积极作用，提示硅藻可能基于必需营养物和辅因子的需求，利用特异性次生代谢物调节藻际中的关联，招募多种短暂性和有益细菌群落。这种调节可能优先发生在链状形成硅藻中，尤其是在响应非生物条件或生活史阶段变化时。基于分析获得的不同网络，可以推测宿主基因型在从不同地理区域、环境或季节中与硅藻共现的原核生物群落中招募微生物方面发挥作用。α-变形菌纲和拟杆菌门被确认为与硅藻相关的优势门类，而其他与角毛藻属相关的原核生物则反映了周围区域（如陆地和淡水）的输入。测序技术的进一步改进将有助于细化分类学定义，并通过宏基因组学方法阐明相关原核生物的功能类群。