神经生长因子治疗与角膜上皮：细胞外囊泡介导的信号传导

《Journal of Extracellular Biology》：Nerve Growth Factor Treatment and the Corneal Epithelium: Extracellular Vesicle-Mediated Signaling

　　

重组人神经生长因子（NGF）用于治疗角膜伤口愈合受损的患者。NGF通过由两种细胞膜受体——TrkA和p75NTR——之一的结合所启动的复杂信号传导过程发挥其作用。虽然胞内信号传导通路已被广泛研究，但NGF如何介导细胞间信号传导以协调伤口愈合仍知之甚少。在此，研究人员证明，角膜上皮响应外源性NGF产生的细胞外囊泡（EVs）对角膜上皮细胞的活力、增殖和迁移产生负面影响。研究发现，响应NGF产生的EVs中miR-34a-3p显著富集，而同一miRNA在NGF处理后的细胞裂解液中表达下调。相反，用miR-34a-3p拮抗剂（miR34a-i）处理可诱导内源性NGF的显著上调，提示miR-34a-3p与NGF之间存在潜在反馈通路。此外，用响应miR34a-i处理所产生的EVs的条件培养基可显著增强角膜上皮的增殖反应。研究人员鉴定出bex3（编码NGF受体相关蛋白1）为miR-34a-3p在NGF信号传导通路中的潜在靶点。这些数据揭示了NGF治疗在角膜上皮中诱导的一种潜在的细胞间负反馈通路。

论文解读

一、研究背景与科学问题

神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF）是神经营养因子家族的原型成员，最初因其对神经元细胞发育和健康的影响而被定义。近年来，NGF在包括人角膜在内的不同组织伤口愈合过程中的重要性日益受到关注。在眼表，泪腺、角膜和结膜上皮以及三叉神经元分泌的NGF在角膜伤口愈合中发挥关键作用。重组人NGF（rhNGF）最近成为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个用于神经营养性角膜炎（一种由角膜神经损伤引起的致盲性疾病）的眼科治疗药物。

NGF通过结合两种细胞表面受体之一——原肌球蛋白激酶受体A（TrkA）或p75神经营养因子受体（p75NTR）——发挥其胞内效应。NGF可调节多种微小RNA（miRNA）的表达，miRNA是一类长度为19至25个核苷酸的非编码RNA，通常通过与靶信使RNA（mRNA）的3‘非翻译区（UTR）相互作用来调节基因表达。由于单个miRNA可能具有众多mRNA靶点，且单个mRNA可能被多个miRNA靶向，miRNA信号传导复杂且尚未被完全理解。

除胞内miRNA信号传导外，NGF还激活复杂的细胞间通讯机制，包括内分泌、旁分泌和自分泌通路。近年来，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）——所有细胞释放的纳米级膜结合颗粒——已成为角膜及其他组织伤口愈合过程中的关键介质。然而，NGF刺激的角膜上皮细胞分泌的EVs的功能贡献尚未被描述。EVs通过其货物含量及其时空分布介导伤口愈合，在诱导应激（即伤口愈合过程中）期间EVs的数量和含量会发生改变。例如，角膜上皮分泌的EVs富含纤连蛋白和层粘连蛋白等细胞外基质蛋白。此外，角膜缘上皮细胞来源的EVs中的miRNAs（如miR-381-3p和miR-199a-3p）可能参与这些EVs的增殖和伤口愈合功能。然而，这些miRNAs的机制仍在评估中，其与外源性生长因子治疗的相关性尚未被广泛研究。

基于上述背景，本研究旨在探究外源性NGF如何通过EVs影响角膜上皮的细胞间通讯，具体包括：表征外源性NGF对角膜缘上皮细胞中miRNA表达及其EVs内miRNA水平的影响，并探索NGF响应性miRNAs与其功能效应之间的潜在机制联系。

二、研究概述与主要结论

研究人员使用永生化人角膜缘上皮（HCLE）细胞系，在100 nM rhNGF处理24小时的条件下，通过小RNA测序、qPCR验证、EVs分离与表征、细胞活力/增殖/迁移功能实验、miRNA拮抗剂转染、ELISA、Western Blot以及Argonaute-RNA免疫沉淀（Ago RIP）等多种技术手段，系统研究了NGF对角膜上皮EVs介导的细胞间信号传导的影响。

研究发现：EVs响应外源性NGF产生后，其内含的miR-34a-3p显著富集，而该miRNA在NGF处理后的细胞裂解液中表达下调；抑制miR-34a-3p可显著上调内源性NGF水平，并增强角膜上皮的增殖反应；bex3（编码NGF受体相关蛋白1）被鉴定为miR-34a-3p在NGF信号通路中的潜在靶点。这些数据揭示了NGF治疗在角膜上皮中诱导的一种潜在的细胞间负反馈通路，为理解生长因子治疗的信号传导机制提供了新视角。

三、主要关键技术方法

本研究采用的主要关键技术方法包括：（1）HCLE细胞培养与rhNGF处理，细胞在基础培养基中营养饥饿24小时后接受100 nM rhNGF或等体积PBS（对照）处理；（2）细胞活力、增殖和迁移功能检测，采用荧光素二乙酸/碘化丙啶（FDA/PI）活死染色、PrestoBlue试剂荧光定量检测以及体外划痕实验；（3）EVs分离与表征，采用差速超速离心法从条件培养基中分离EVs，通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、外泌体抗体芯片以及ExoView R100平台进行理化表征；（4）miRNA分离与测序，使用mirVana miRNA分离试剂盒提取EVs和细胞中的miRNA，进行Illumina Hiseq 4000单端50 bp测序，并利用Gene Ontology（GO）和KEGG通路数据库进行生物信息学分析；（5）细胞转染，使用Lipofectamine 3000将miR-34a-3p mimic或antagomir（miR34a-i）转染至HCLE细胞；（6）qPCR定量验证miRNA和基因表达；（7）ELISA检测NGF蛋白水平；（8）Western Blot检测p75NTR蛋白表达；（9）Argonaute-miRNA免疫沉淀（Ago RIP）验证miRNA靶标。

四、研究结果

3.1 RhNGF诱导角膜上皮细胞中miRNA差异表达

研究人员对经100 nM rhNGF或PBS（对照）处理24小时的HCLE细胞裂解液进行小RNA测序（单生物学重复，用于假设生成），共检测到833个独特miRNAs，其中407个上调、64个下调。GO富集分析显示差异表达miRNAs显著富集于蛋白质结合、外泌体和膜相关功能。KEGG富集分析显示差异表达miRNAs显著涉及癌症和PI3K-Akt信号通路——这些通路参与细胞生长、增殖和存活的调节。该结果提示rhNGF诱导的外泌体可能在介导细胞增殖反应中发挥作用。

3.2 RhNGF未显著改变角膜上皮细胞EVs的理化特性

研究人员采用差速超速离心法从rhNGF处理（EV^NGF+）或PBS对照（EV^NGF?）的HCLE细胞条件培养基中分离EVs。TEM成像显示两组EVs形态相似，均呈特征性的碟形颗粒。两组EVs均为Alix、EpCAM和TSG101阳性，符合EVs生物标志物的既定标准。两组EVs的四次跨膜蛋白组成相似，EV^NGF+表现出更高比例的CD63/CD81+ EVs和更低比例的CD81/CD9+ EVs。EV^NGF+和EV^NGF?的粒径分布相似（直径分别为151.8 ± 11.9 nm和156.2 ± 5.9 nm，p > 0.05）。rhNGF处理后的HCLE培养基中EVs丰度高于对照细胞（相对颗粒数1.32 ± 0.16，p = 0.02）。ELISA检测显示EV^NGF?中NGF水平不可检测，而EV^NGF+中每百万EV颗粒含6.02 pg NGF。

3.3 rhNGF响应性EVs在超生理浓度下降低角膜上皮细胞增殖和迁移

研究人员将EV^NGF+和EV^NGF?以等效浓度添加到处理前未接触EVs的HCLE细胞中，评估其对细胞活力、增殖和迁移的影响。活死染色显示，以10⁷颗粒/mL浓度孵育24小时，EV^NGF+导致显著细胞死亡，而等效浓度的EV^NGF?无此效应。基于刃天青的荧光定量检测在10⁶、10⁷和10⁸颗粒/mL浓度范围内确认了这一结果：EV^NGF?仅在10⁸颗粒/mL浓度下对细胞活力有轻微但统计学显著的正面影响，而EV^NGF+在所有测试浓度下均以剂量依赖方式显著降低细胞活力，在10⁸颗粒/mL浓度下细胞活力降低约65%。体外划痕实验显示，未处理细胞在12小时后平均实现67.7% ± 7.0%的伤口闭合，而经10⁶、10⁷和10⁸颗粒/mL EV^NGF+处理的细胞在相同时间内分别仅实现51.2% ± 7.5%、32.8% ± 19.3%和4.9% ± 5.2%的伤口闭合。EV^NGF?在任何测试浓度下对伤口闭合均无显著影响。质控实验确认EV^NGF+组分缺乏GM130和钙联蛋白细胞组分标志物，排除了细胞器污染作为负面功能效应的原因。值得注意的是，在另一项实验中，将未经100 kDa过滤的等体积条件培养基直接暴露于处理前细胞时，EV^NGF+和EV^NGF?对细胞活力的总体影响不显著，表明上述发现代表EV^NGF+相对于生理条件的生物学功能的放大表现。

3.4 rhNGF处理后HCLE细胞来源EVs中小非编码RNA的表达模式

研究人员对单生物学重复批次的EV^NGF+和EV^NGF?进行小RNA测序，共检测到105个独特miRNAs，其中42个上调、9个下调。上调的miRNAs包括let-7家族的多个成员，该家族通常被认为具有肿瘤抑制（即抗增殖）特性。GO富集分析显示与HCLE细胞分析相似的分布，包括与蛋白质结合和细胞膜相关的miRNAs。KEGG富集分析显示与HCLE细胞测序分析相似的通路，包括与癌症、PI3K-Akt信号传导以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导相关的miRNAs。

3.5 NGF的抗增殖效应部分由miR-34a-3p介导

研究人员使用qPCR验证EVs中差异表达的miRNAs。虽然测序结果显示let-7 miRNAs在EV^NGF+中最为过表达，但qPCR分析未显示let-7在EVs中有统计学显著的富集。然而，qPCR确实揭示了另一种肿瘤抑制miRNA——miR-34a-3p在EV^NGF+中显著富集（1.4 ± 0.3倍变化，p = 0.03）。相反，NGF处理后HCLE细胞裂解液中miR-34a-3p表达显著降低（0.4 ± 0.2倍变化，p = 0.02），提示miR-34a-3p可能是HCLE细胞中的NGF效应分子。

为进一步研究miR-34a-3p与NGF之间的潜在相互作用，研究人员用antagomiR-34a-3p（miR34a-i）转染HCLE细胞，确认miR-34a-3p水平显著降低（0.28 ± 0.31倍变化，p = 0.02）。rhNGF处理的miR34a-i转染细胞中miR-34a-3p表达进一步降低（0.20 ± 0.08倍变化，p = 0.0003）。此外，miR34a-i处理细胞的胞内NGF水平较对照显著升高（5.1 ± 2.6 vs. 1.0 ± 0.54 ng/mg蛋白，p = 0.03）。有趣的是，先转染miR34a-i再接受rhNGF处理的细胞，其胞内NGF水平（26.0 ± 1.2 ng/mg蛋白）远高于无模板对照（NTC）细胞（9.1 ± 1.1 ng/mg蛋白，p = 0.0005）。

这些变化与细胞条件培养基的功能结果相关。rhNGF处理显著提高HCLE细胞活力（1.8 ± 0.5倍变化，p = 0.04）。rhNGF处理细胞的条件培养基同样增强细胞活力和增殖（细胞活力1.2 ± 0.1倍变化，p = 0.04）。miR34a-i转染后HCLE细胞分泌的EVs在理化特性上与对照无明显差异，但miR34a-i转染产生的细胞活力增加（1.6 ± 0.2倍变化，p = 0.04）甚至大于单独rhNGF处理。

3.6 miR-34a-3p可能通过bex3的转录后调控调节NGF信号通路

研究人员发现抑制miR-34a-3p导致HCLE细胞中p75神经营养因子受体（p75NTR，又称NGFR）表达显著增加（p = 0.04）。利用在线工具TargetScan鉴定miR-34a-3p的潜在靶点，发现NGF和NGFR基因均不是miR-34a-3p的预测靶点。然而，miR-34a-3p的一个已报道靶点是NGF受体相关蛋白1（NGFRAP1，即BEX3），该蛋白作为p75NTR的衔接蛋白参与NGF信号传导。在BEX3 mRNA的3‘ UTR区域鉴定到一个7mer-A1种子序列匹配，并通过Sfold STarMirDB在线预测软件验证。为验证该靶点预测，研究人员在转染miR-34a-3p mimic的细胞中进行人Argonaute（Ago）蛋白RNA免疫沉淀（Ago RIP）。结果显示，从miR-34a-3p过表达HCLE细胞中免疫沉淀的Ago蛋白与miR-34a-3p高度结合（p = 0.01），NGFR未与Ago蛋白显著共沉淀（p = 0.99），而bex3在miR-34a-3p过表达细胞中与Ago蛋白共沉淀（p = 0.04），表明miR-34a-3p可能在转录后水平调节bex3表达。

五、讨论与结论

本研究数据表明，角膜上皮响应外源性NGF处理产生的EVs可能含有对角膜上皮细胞健康和伤口愈合过程产生负面影响的成分。具体而言，研究人员在这些EVs中发现miR-34a-3p的过度富集——抑制该miRNA可大幅增强NGF的增殖效应。

NGF已知主要通过TrkA受体在神经元细胞中产生促生存效应，包括通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信号传导。此外，大量体外和体内研究已证明NGF是角膜上皮的促生存因子和角膜伤口愈合的强效刺激剂。然而，NGF信号传导复杂，可能涉及依赖于细胞背景的相反通路。例如，NGF通过p75NTR的信号传导根据细胞类型介导对细胞存活和凋亡的相反效应，并可能通过JNK和NF-κB通路诱导促凋亡信号传导。在角膜背景下，NGF可能诱导角膜新生血管形成，NGF-p75NTR信号传导可能参与局部NGF治疗的重要不良效应之一——疼痛。因此，在使用NGF作为治疗手段时，理解这些复杂信号传导过程至关重要。

EVs正日益被认为是细胞间通讯和信号传导通路的重要介质。例如，包括角膜上皮细胞和基质角膜细胞在内的各种细胞释放的EVs已被证明是角膜伤口愈合复杂过程的重要介质。此外，最近已将从再生角膜上皮收集的EVs用作促进角膜伤口愈合的治疗方法。然而，据研究人员所知，角膜响应NGF等生长因子产生的EVs尚未被广泛研究。本研究发现，虽然生理状态下HCLE细胞来源的EVs对HCLE细胞活力、增殖或迁移无显著影响，但即使低浓度的EV^NGF+也能显著抑制这些过程。研究人员确认这些变化并非由于EVs中包装的NGF水平升高所致，因为EVs内的有效NGF浓度仍远低于治疗浓度。

关于EVs负面功能效应的机制，研究人员聚焦于EVs的miRNA含量。小RNA测序提示EV^NGF+中多个肿瘤抑制miRNAs富集，包括let-7家族的多个成员。然而，测序数据来自单生物学重复，仅可视为探索性结果。qPCR验证显示miR-34a-3p在EV^NGF+中显著富集。miR-34家族miRNAs已被充分证明通过NGF诱导的信号通路介导神经元发育和分化。NGF诱导miR-34a产生增加，且miR-34a在抑制成熟神经元细胞增殖中发挥重要作用。本研究发现NGF诱导角膜上皮细胞内miR-34a-3p表达降低，同时增加角膜上皮细胞来源EVs中miR-34a-3p的丰度。选择性将miR-34a-3p包装入EVs可能代表NGF发挥旁分泌信号传导的一种方式，可能作为负反馈信号。由于研究人员间接发现miR-34a-3p抑制HCLE细胞中内源性NGF的产生，EVs包装miR-34a-3p可能代表一种调节局部组织对NGF过量反应的机制。

关于miR-34家族调节NGF信号传导的机制，Ago RIP实验表明bex3（NGFRAP1）与过表达的miR-34a-3p共沉淀。Bex3属于Bex（脑表达X连锁）基因家族，最初因其参与p75NTR驱动的NGF诱导凋亡通路而被称为p75相关死亡执行因子（NADE），但也已被发现在神经元中促进细胞存活和神经突生长中发挥重要作用。BEX3蛋白已被证明通过关联trkA启动子区域促进TrkA产生。本研究提示BEX3可能通过EV相关的miR-34a-3p诱导的NGF响应在角膜上皮的NGF信号传导中发挥重要作用。

综上所述，本研究描述了一种NGF影响细胞间通讯的潜在新机制，具体通过EV相关的miR-34a-3p实现。角膜上皮响应外源性NGF产生的EVs可能具有部分通过miR-34a-3p和bex3表达的转录后调控介导的负调控机制。进一步研究EV介导的细胞间生长因子信号传导通路对于更好地理解和优化基于生长因子的治疗至关重要。