产前雄激素暴露与发育阶段改变雌性小鼠促性腺激素释放激素神经元电压门控钙通道活性

《Journal of Neuroendocrinology》：Voltage-gated calcium channel activity of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons is altered by age and by prenatal androgen exposure in female mice

　　

摘要专业翻译 多囊卵巢综合征（polyendocrine metabolic ovarian syndrome, PMOS），一种常见的不孕症病因，其特征是持续高频率的黄体生成素（luteinizing hormone, LH）脉冲，这很可能是由高频的促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）脉冲所驱动。产前雄激素化（prenatally androgenized, PNA）小鼠模拟了包括高LH脉冲频率在内的神经内分泌PMOS症状。成年PNA小鼠的GnRH神经元自发发放频率高于溶剂对照（vehicle, VEH）小鼠；而在青春期的PNA小鼠中，尽管在两个年龄段都存在更多的兴奋性输入，但这种差异却发生了逆转。研究人员假设电压门控Ca2+电流（ICa）有助于设定GnRH神经元的固有兴奋性，并且会因发育和/或PNA处理而改变。研究人员对3周龄和成年的VEH与PNA小鼠的GnRH神经元进行了全细胞膜片钳记录，测量其ICa和兴奋性。PNA处理在两个年龄段均增加了ICa密度并使ICa半失活电位去极化。在成年小鼠中，无论是否接受PNA处理，Ca2+电导的半激活电位均发生去极化，且快ICa成分的半失活时间增加。对电流注入的发放反应存在年龄相关性变化，这主要由3周龄VEH小鼠更高的发放率驱动；3周龄PNA小鼠则表现出成年样反应。用蜂毒明肽（apamin）阻断小电导Ca2+激活K+电流可增加GnRH神经元的发放频率，但在成年PNA小鼠中除外。蜂毒明肽将锋电位后串膜电位反应从超极化转变为去极化；在发育过程中，蜂毒明肽的这种净效应在PNA小鼠中较小。总之，PNA小鼠的GnRH神经元具有更高的ICa和改变的ICa动力学。Ca2+激活的K+电流在成年PNA小鼠的GnRH神经元中不太显著，这可能促成了其自发性发放活动的增加。

论文解读文章

1. 研究背景与科学问题

在脊椎动物中，位于视前区（preoptic area, POA）和下丘脑的神经元以脉冲方式分泌促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH），这是调控生殖的最终神经机制。GnRH刺激垂体前叶分泌黄体生成素（luteinizing hormone, LH）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH）。GnRH脉冲频率在女性生殖周期中变化，并在驱动LH和FSH的差异化释放中发挥作用。GnRH/LH模式的紊乱可导致不孕，如多囊卵巢综合征（polyendocrine metabolic ovarian syndrome, PMOS）。PMOS患者表现为持续性高LH脉冲频率，推测由高频GnRH脉冲驱动，并对性类固醇负反馈产生抵抗。这种激素失调可能在青春期转变之前或期间就已开始。

PMOS的病因尚不完全清楚。除了可能的遗传原因外，宫内雄激素暴露可能重新编程胎儿，使其在成年后出现类似PMOS的特征。与此假说一致，产前雄激素化（prenatally androgenized, PNA）小鼠模型表现出类似于人类PMOS的神经内分泌特征，包括LH脉冲频率升高。先前的研究发现，PNA小鼠的GnRH神经元自发性动作电位发放频率在成年期增加，但在青春期（3周龄）反而低于对照组。这些发放率的改变可能是突触输入和内在特性变化整合的结果。已知电压门控Ca²⁺电流在介导GnRH神经元的兴奋-分泌耦联和调节爆发式放电中起重要作用，但尚不清楚Ca²⁺电流是否受到发育和/或PNA处理的影响。因此，本研究旨在探究对照组小鼠青春期前后GnRH神经元中电压门控Ca²⁺电流的变化，以及PNA处理是否会改变Ca²⁺电流的特性。同时，研究人员还测试了小电导Ca²⁺激活K⁺（small-conductance Ca²⁺-activated K⁺, SK）电流在对照组和PNA小鼠青春期前后对GnRH神经元兴奋性的影响。

2. 主要关键技术方法

研究人员使用了靶向GnRH神经元表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的转基因小鼠（GnRH-GFP小鼠，CBA-Tg(Gnrh1-EGFP)51Sumo/J品系，C57Bl6/J背景），并建立了PNA小鼠模型（于妊娠第16至18天给孕鼠皮下注射双氢睾酮dihydrotestosterone, DHT）。研究采用全细胞膜片钳技术，分别对离体脑片中的GnRH神经元进行电压钳和电流钳记录，以测量电压门控Ca²⁺电流和神经元的固有兴奋性。实验中使用了药理学手段分离不同电流成分，例如利用不同预脉冲电压区分快和中等慢速失活的Ca²⁺电流成分，并使用蜂毒明肽（apamin） 特异性阻断SK电流以评估其对神经元兴奋性的影响。数据分析采用了多种统计方法，包括三因素方差分析和两因素方差分析等。

3. 研究结果

3.1 产前雄激素化表型的验证

研究人员通过阴道开口（vaginal opening, VO）年龄、肛门生殖器距离（anogenital distance, AGD）和动情周期来确认PNA诱导的表型差异。结果显示，PNA小鼠表现出更早的VO、更大的AGD以及紊乱的动情周期，证实了模型的有效性。

3.2 PNA处理增加GnRH神经元Ca²⁺电流密度

通过全细胞电压钳记录，研究人员发现，无论处于青春期还是成年期，PNA小鼠GnRH神经元的总Ca²⁺电流密度，以及其快失活和中等慢速失活两个亚成分的电流密度均高于VEH对照组。这表明PNA处理普遍增强了GnRH神经元的Ca²⁺内流能力。

3.3 发育影响Ca²⁺电导的电压依赖性激活

研究人员分析了Ca²⁺电导的电压依赖性激活曲线。结果表明，总Ca²⁺电导和中等慢速Ca²⁺电导的半激活电位（V_{0.5 act}）在成年小鼠的GnRH神经元中比在3周龄小鼠中更去极化，即需要更强的去极化才能达到半数最大激活。这一发育性变化不受PNA处理影响。

3.4 GnRH神经元快Ca²⁺电流的电压和时间依赖性失活

针对快失活Ca²⁺电流（fast I_Ca）的分析显示，PNA处理使该电流的电压依赖性失活曲线右移，即半失活电位（V_{0.5 inact}）去极化，表明PNA小鼠的GnRH神经元对电压依赖性失活更具抵抗力。此外，发育影响了时间依赖性失活：成年小鼠GnRH神经元的快I_Ca失活速度比3周龄小鼠更慢，其半失活时间（T_{0.5 inact}） 更长。两种处理均未影响快I_Ca的时间依赖性恢复。

3.5 3周龄PNA小鼠的GnRH神经元表现出成年样的电流注入发放反应

在无EGTA缓冲的电流钳记录中，研究人员观察到GnRH神经元的兴奋性受年龄影响。具体而言，3周龄VEH小鼠的发放率最高，而3周龄PNA小鼠的发放率已降至成年水平，呈现出“成年样”的反应模式。动作电位特性分析也显示，3周龄VEH小鼠的动作电位阈值更超极化、后超极化电位（afterhyperpolarization potential, AHP）时间更短、幅度更低，这些特性在3周龄PNA小鼠中也更接近成年状态。

3.6 阻断SK电流增加GnRH神经元发放率，但成年PNA小鼠除外

应用SK通道阻断剂蜂毒明肽后，大多数实验组的GnRH神经元发放频率显著增加。然而，成年PNA小鼠的GnRH神经元对蜂毒明肽的反应明显减弱，其发放频率的增加不显著。这提示成年PNA小鼠的SK电流功能可能受损。

3.7 PNA小鼠GnRH神经元锋电位后串膜电位变化的组分改变

在基线条件下，PNA处理使GnRH神经元锋电位后串快速膜电位变化（fast ΔV_m） 的值偏向去极化方向。在蜂毒明肽处理后，所有组都暴露出一个锋电位后串去极化。其中，3周龄PNA小鼠的去极化幅度最高，到成年期下降至VEH水平。通过减法获得的蜂毒明肽敏感性（SK介导的）超极化的幅度和面积在3周龄PNA小鼠中有增大趋势，但在成年期显著降低。这些结果进一步支持了PNA小鼠中SK电流功能随发育发生异常改变的观点。

4. 总结与讨论

本研究表明，PNA处理和发育过程均能独立地改变GnRH神经元的电压门控Ca²⁺电流特性。PNA处理导致GnRH神经元的总Ca²⁺电流密度及其快、慢两个亚成分的电流密度均增加，并使快失活Ca²⁺电流的电压依赖性失活曲线向去极化方向移动（即更不易失活）。与此同时，发育过程则主要影响Ca²⁺电导的激活特性（成年后激活所需电压更高）和快失活Ca²⁺电流的失活动力学（成年后失活更慢）。

更重要的是，研究发现PNA小鼠的GnRH神经元在青春期就已表现出成年样的低兴奋性，这与它们成年后自发发放频率增高的现象形成对比。研究人员认为，这种看似矛盾的现象可能与SK电流功能的动态变化有关。在青春期PNA小鼠中，虽然Ca²⁺内流增加，但同时伴随着更强的SK电流活动（表现为更大的SK介导的超极化），从而限制了神经元的整体兴奋性。然而，到了成年期，PNA小鼠的SK电流功能显著减弱，使得增加的Ca²⁺内流不再受到有效制约，最终导致其自发性发放频率增高。这种从青春期到成年期SK电流功能的转变，可能是解释PNA小鼠GnRH神经元兴奋性发育轨迹异常的关键机制，并可能为理解PMOS患者中高频GnRH/LH脉冲的发生提供新的神经生物学基础。