TWIK-2钾离子漏通道与星形胶质细胞信号调控大鼠迷走神经背核气道黏液分泌运动神经元的电生理特性

《The Journal of Physiology》：Electrophysiological properties of the dorsal motor nucleus of the vagus motoneurones controlling airway mucus secretion in rats

　　

摘要专业翻译 支配呼吸气道的副交感传出神经控制支气管收缩和黏液分泌。已知投射至气道的副交感呼吸运动神经元（parasympathetic respiratory motoneurones, PRMNs）位于疑核（nucleus ambiguus, NA）和迷走神经背核（dorsal motor nucleus of the vagus, DMV）。尽管NA的PRMNs在生理和病理条件下均被证实调节支气管收缩，但DMV的PRMNs电生理特性及其在调节气道中的功能作用尚不完全清楚。研究人员采用逆行标记、神经元和通气记录、光遗传学、化学遗传学以及体外和体内大鼠模型的组织学和分子分析，评估了控制DMV PRMNs活性的电生理特征及其在气道黏液分泌中的作用。DMV PRMNs呈现以K+为主的漏电流，由双孔域TWIK-2通道介导，该通道调节其静息膜电位、放电频率及对酸中毒的兴奋反应。酸中毒还减少了对这些运动神经元的突触抑制，并激活DMV中的星形胶质细胞。此外，星形胶质细胞的光遗传学激活诱导DMV PRMNs产生动作电位，由谷氨酸能NMDA受体兴奋介导。最后，DMV PRMNs的化学遗传学激活在呼吸道中诱发黏液分泌并增加叹气频率，而不影响炎症细胞浸润、肺通气、氧耗或心率。因此，研究数据表明，TWIK-2漏通道和星形胶质细胞信号调节DMV PRMNs的活性及其在大鼠气道黏液分泌中的作用。

论文解读

一、研究背景与科学问题

自主神经系统在调节气道功能中发挥重要作用。气道主要受副交感神经支配，调控平滑肌张力、黏膜下腺体分泌和血流。副交感传出神经支配来源于位于迷走神经背核（dorsal motor nucleus of the vagus, DMV）和疑核（nucleus ambiguus, NA）的运动神经元。NA的副交感呼吸运动神经元（parasympathetic respiratory motoneurones, PRMNs）具有B纤维轴突，已知在每个呼吸周期中控制气道阻力，这种阶段性支气管收缩对降低肺泡CO₂分压、减少通气传导区容积和峰值呼气流速、促进肺泡气体交换具有重要作用。近期研究证实，NA运动神经元控制过敏原暴露引起的气道高反应性，但不控制气道黏液分泌或肺部炎症。相比之下，DMV PRMNs具有慢传导C纤维，既不调节阶段性支气管收缩，也不调节过敏原诱导的气道高反应性，但可能调节气道分泌和血流，这些功能需要持续激活，可能通过持续神经元活动实现。这与先前研究显示的DMV PRMNs呈现约3 Hz的低而稳定的基础紧张性活动一致。

然而，尚无研究对DMV PRMNs的电生理特性进行完整分类。神经元兴奋性还依赖于在静息膜电位（resting membrane potential, RMP）附近活跃的离子通道，如双孔域K⁺漏通道（KCNK或K2P家族）。DMV运动神经元表达K2P TWIK相关酸敏感K⁺（TASK）通道，特别是TASK-1和TASK-3。但这些DMV运动神经元的投射靶点尚未被证实，因此这些通道是否调节PRMNs的RMP及其对酸中毒的敏感性仍属未知。鉴于急性重症哮喘中可能发生代谢性酸中毒，TASK通道的pH敏感性可能代表该病理条件下DMV PRMN活动的重要调节机制。此外，在婴儿猝死综合征死亡婴儿的脑干标本中检测到DMV异常，提示PRMNs介导的副交感信号失调可能导致呼吸功能受损。

近年研究还表明，星形胶质细胞积极参与信息处理，通过调节神经元功能发挥作用。在脑干中，星形胶质细胞已被证明可调节参与呼吸、压力反射、中枢CO₂/pH敏感性和食物摄入的神经元活动和回路功能，这些效应通过释放胶质递质如ATP和谷氨酸介导。近期研究证明，抑制星形胶质细胞可减少DMV运动神经元的谷氨酸能兴奋及其兴奋性，影响大鼠胃功能。然而，星形胶质细胞调节DMV PRMN活性的作用尚未被研究。因此，本研究旨在验证以下假说：K⁺漏TASK通道、突触传递和星形胶质细胞信号调节DMV PRMNs的活性及其在大鼠气道分泌中的作用。

二、主要技术方法

研究人员使用雄性Wistar Hanover大鼠（6周龄，来自巴西圣保罗大学Ribeir?o Preto校区动物护理设施）开展实验。关键技术方法包括：通过肺内注射逆行腺相关病毒（AAVrg-EF1a-Cre）结合DMV内注射Cre依赖性病毒载体，实现DMV PRMNs和星形胶质细胞的选择性转染；采用全细胞膜片钳技术记录DMV PRMNs和星形胶质细胞的电生理特性；使用单细胞定量实时PCR（RT-qPCR）分析K2P通道mRNA表达；运用光遗传学（Channelrhodopsin 2, ChR2）激活星形胶质细胞；运用化学遗传学（HM3D(Gq)设计受体）激活DMV PRMNs；通过全身体积描记法测量通气参数、代谢参数和心电图；采用PAS染色评估气道黏液分泌；结合免疫荧光和共聚焦显微镜进行组织学分析。

三、研究结果

K⁺为主的漏电流控制DMV PRMNs的静息膜电位。 研究人员在阻断GABA能、甘氨酸能、AMPA和NMDA谷氨酸能突触传递及多种电压激活通道的条件下，使用斜坡协议构建电流-电压关系。PRMNs的漏电导（G_leak）为1.73 ± 0.63 nS，漏电流反转电位（E_leak）为?64.35 ± 4.57 mV，较K⁺平衡电位（?91.57 mV）去极化，表明漏电导以K⁺为主，同时有内向阳离子电流的贡献。

酸中毒通过减少K⁺为主的漏电流使DMV PRMNs去极化并增加放电频率。 在pH 6.9（通过降低HCO₃^?浓度或升高CO₂至15%实现）条件下，G_leak显著降低，E_leak无显著变化。酸中毒使RMP显著去极化（pH 6.9/5% CO₂：?50.23 ± 5.77 vs. ?56.47 ± 5.44 mV；pH 6.9/15% CO₂：?44.42 ± 3.18 vs. ?50.09 ± 1.88 mV），且可逆。酸中毒还使自发放电频率从3.35 ± 0.81 Hz显著增加至5.27 ± 0.6 Hz。TASK通道阻断剂奎尼丁（quinidine，50和100 μm）不影响PRMNs的RMP，也不能阻止酸中毒引起的去极化，提示TASK通道不参与介导该效应。

DMV PRMNs表达TWIK-2和THIK-2漏通道。 单细胞RT-qPCR分析显示，DMV PRMNs不表达TASK-1、TASK-3、THIK-1、TREK-1、TREK-2、TASK-2、TWIK-1或TRESK通道mRNA，但所有被分析的PRMNs均表达TWIK-2和THIK-2通道mRNA。

TWIK-2通道参与DMV PRMNs的K⁺为主漏电流及其酸中毒敏感性。 TWIK-2通道阻断剂ML365（10 μm）显著降低G_leak（0.99 ± 0.34 vs. 1.79 ± 0.22 nS），且随后给予酸中毒不再产生额外效应，提示两者通过共同机制发挥作用。ML365还使PRMNs去极化（?44.96 ± 1.74 vs. ?49.11 ± 1.26 mV）并增加放电频率（5.12 ± 0.86 vs. 3.63 ± 0.99 Hz）。

酸中毒减少DMV PRMNs的抑制性突触传递，但不影响AMPA兴奋性突触传递。 酸中毒（pH 6.9）不影响AMPA自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）的频率和幅度，但显著降低GABA能和甘氨酸能自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）的频率（GABA：13.68 ± 2.87降至3.81 ± 2.1 Hz；甘氨酸：9.81 ± 2.3降至6.43 ± 1.88 Hz），而不影响其幅度。

酸中毒激活DMV星形胶质细胞。 在TTX存在下，酸中毒显著降低DMV星形胶质细胞的维持电流（I_holding：120.2 ± 41.52降至33.44 ± 27.01 pA）和膜电导（5.46 ± 1.88降至1.52 ± 1.22 nS），并使RMP从?76.39 ± 2.12 mV去极化至?68.15 ± 4.47 mV，这些效应均可逆。

DMV星形胶质细胞激活通过NMDA谷氨酸能信号招募PRMNs。 光遗传学激活星形胶质细胞诱导PRMNs强去极化并增加放电频率（34.35 ± 8.26 vs. 3.99 ± 0.76 Hz）。在阻断GABA能、甘氨酸能和AMPA谷氨酸能突触传递及TTX后，去极化仍存在，但NMDA受体拮抗剂DL-AP5完全消除了该效应。在40 mV电压钳下，星形胶质细胞激活诱导PRMNs产生缓慢发展的外向电流，该电流也被DL-AP5抑制。

DMV PRMNs对酸中毒的反应依赖于TWIK-2通道和NMDA介导的谷氨酸能信号。 在ML365存在下，酸中毒仍可进一步去极化PRMNs并增加放电频率，但加入DL-AP5后，酸中毒对RMP和放电频率的效应被完全消除，表明酸中毒的兴奋效应同时依赖TWIK-2通道抑制和NMDA受体依赖性谷氨酸能信号。

DMV PRMNs激活诱导呼吸道黏液分泌。 化学遗传学激活DMV PRMNs后，肺组织中PAS染色阳性面积显著增加（80.87 ± 28.17 vs. 11.31 ± 11.68 μm²），表明黏液分泌增强，但未观察到炎症细胞浸润。通气参数（呼吸频率、潮气量、肺通气量）、氧耗和心率均不受影响，而叹气频率显著增加（15.5 ± 1.87 vs. 10 ± 1.41次/小时）。

四、讨论与结论

本研究首次发现，由TWIK-2通道介导的K⁺为主漏电流调节大鼠胆碱能DMV PRMNs的静息膜电位、放电频率及其对酸中毒的反应。尽管既往研究认为脑干运动神经元高表达TASK-1和TASK-3通道，且DMV运动神经元的K⁺漏电流可能由TASK-3介导，但本研究通过单细胞RT-qPCR明确证明DMV PRMNs不表达TASK-1或TASK-3 mRNA，TASK通道阻断剂奎尼丁也不影响其RMP或酸中毒敏感性。相反，DMV PRMNs表达TWIK-2和THIK-2通道，其中TWIK-2是功能性通道且其电流被酸中毒抑制、对奎尼丁不敏感，与本研究观察到的电生理特征一致。酸中毒还减少GABA能和甘氨酸能抑制性突触传递，并激活DMV星形胶质细胞，后者通过释放谷氨酸激活NMDA受体增强PRMNs兴奋性。最终，DMV PRMNs的持续激活诱导气道黏液分泌并增加叹气频率，但不影响肺通气、氧耗或心率，证实DMV PRMNs在调节气道分泌功能中的特异性作用。

研究结论：TWIK-2漏通道和星形胶质细胞谷氨酸能信号调节DMV PRMNs的活性及其在大鼠气道黏液分泌中的作用。该研究揭示了DMV PRMNs调控气道分泌的新的分子和细胞机制，对理解气道分泌的神经调控及其在代谢性酸中毒等病理条件下的变化具有重要生理学和临床意义。