叶酸靶向聚合物胶束增强紫檀芪在正位大鼠模型中的抗胶质瘤疗效

《Neurotherapeutics》：Folate-Targeted polymeric micelles enhance the anti-glioma efficacy of pterostilbene in an orthotopic rat model

　　

紫檀芪（Pterostilbene）是一种具有广泛治疗潜力的神经活性芪类化合物，其临床转化受到水溶性差和脑内蓄积不足的阻碍。为解决这些局限性，研究人员利用聚（乙二醇）-嵌段-聚（ε-己内酯）共聚物开发了一种叶酸受体靶向聚合物胶束系统（F–Pt/M）。优化后的F–Pt/M表现出较小的水合粒径（约133 nm）、高载药量，并使紫檀芪的表观溶解度提高了25倍。在表达叶酸受体的U251和RG-2胶质瘤细胞中，F–Pt/M通过叶酸介导的内吞作用显著增强了细胞摄取，并显示出优于非靶向胶束的细胞毒性。在正位RG-2胶质瘤模型中，静脉注射F–Pt/M改善了脑内蓄积，并使中位生存期较游离药物延长了76.5%。机制上，增强的抗胶质瘤疗效与诱导细胞凋亡和抑制STAT3信号通路相关。这些发现确立了叶酸靶向胶束作为将难溶性生物活性化合物递送至大脑的稳健且多功能的纳米平台，紫檀芪也是进一步神经肿瘤学开发的有前景的候选药物。

胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是最具侵袭性的原发性脑肿瘤，约占原发性颅内肿瘤的60%。目前标准治疗为手术切除联合放疗和化疗，但血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）和血脑肿瘤屏障（Blood-Brain Tumor Barrier, BBTB）可排除超过98%的小分子药物到达肿瘤部位，常导致治疗失败和肿瘤复发。紫檀芪（Pterostilbene, Pt）是白藜芦醇的天然二甲基化类似物，具有神经保护和抗肿瘤活性，但其极差的水溶性和低生物利用度严重阻碍了临床转化。因此，开发能够提高紫檀芪溶解度并实现脑靶向递送的纳米平台具有重要意义。研究人员假设叶酸修饰的聚合物胶束能够克服上述障碍，并系统评估其抗胶质瘤作用及机制。

研究人员利用聚（乙二醇）-嵌段-聚（ε-己内酯）共聚物（mPEG₂₀₀₀-PCL₂₀₀₀和FA-PEG₃₄₀₀-PCL₂₀₀₀）通过薄膜水化法制备了叶酸靶向载紫檀芪胶束（F–Pt/M）。该制剂粒径约133 nm，载药量为20.8%，可将紫檀芪表观溶解度提高25倍。体外实验显示，F–Pt/M通过叶酸受体介导的内吞作用显著增强U251和RG-2胶质瘤细胞的摄取，并较非靶向胶束具有更强细胞毒性。在正位RG-2胶质瘤大鼠模型中，静脉注射F–Pt/M提高了脑内蓄积，中位生存期较游离药物延长76.5%。机制研究表明，F–Pt/M的抗肿瘤作用与诱导凋亡和抑制STAT3信号通路有关。该研究为紫檀芪等难溶性神经活性化合物的脑内递送提供了新策略。

关键技术方法：研究人员采用薄膜水化法制备F–Pt/M，所用共聚物mPEG₂₀₀₀-PCL₂₀₀₀和FA-PEG₃₄₀₀-PCL₂₀₀₀购自西安瑞禧生物技术；表征包括动态光散射（DLS）、扫描电镜（SEM）、差示扫描量热（DSC）等；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）验证大鼠血浆中紫檀芪的定量方法；细胞毒性采用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8, CCK-8）法；细胞摄取用香豆素-6（Coumarin-6, C6）标记；脑靶向用近红外染料DiR进行活体成像；正位胶质瘤模型采用SD大鼠（大连医科大学实验动物中心，SCXK（辽）2020-0001），立体定向植入大鼠胶质瘤RG-2细胞（洛桑大学医学院提供）；分子机制通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）、Western blot、免疫组化（IHC）、分子对接和分子动力学（MD）模拟研究。

**F–Pt/M的制备与表征**：通过薄膜水化法制备的F–Pt/M呈球形单分散，水合粒径为133.2±1.2 nm（PDI=0.19±0.02），Zeta电位为?8.93±0.22 mV；包封率（EE）为98.6±0.8%，载药量（DL）为20.8±0.4%，紫檀芪浓度达545.6 μg/mL（溶解度提高25倍）；临界聚集浓度（CAC）为2.34 μg/mL；DSC证实紫檀芪以无定形状态包载于胶束中。

**LC-MS/MS方法验证**：建立了灵敏、特异性的定量方法，线性范围20–2000 ng/mL，最低定量限（LOQ）为20 ng/mL；日内和日间精密度（RSD）及准确度（RE）均符合生物样品分析要求；提取回收率和基质效应稳定，满足药代动力学研究需求。

**药代动力学研究**：在大鼠中，游离紫檀芪和F–Pt/M的药时曲线均符合二室模型。F–Pt/M的血浆AUC和Cmax显著低于游离药物，这与网状内皮系统清除及药物快速分布至脑组织有关。F–Pt/M使脑内紫檀芪AUC提高约2倍，脑靶向指数为4.89，证实叶酸修饰显著改善脑靶向效率。

**细胞毒性实验**：空白胶束（BM）在两种胶质瘤细胞中显示良好生物相容性。所有含药制剂均呈剂量依赖性细胞毒性。F–Pt/M在U251细胞中IC₅₀为29.15 μM，显著低于非靶向Pt/M（57.10 μM），与游离药物（27.88 μM）相当；在RG-2细胞中亦表现出类似趋势。

**细胞摄取实验**：以C6为荧光探针，F–C6/M在U251和RG-2细胞中的荧光强度明显强于C6/M；过量游离叶酸预处理可显著抑制F–C6/M的摄取，证实摄取由叶酸