《Non-coding RNA Research》：circHIPK3 promotes pro-fibrotic epithelial reprogramming via the miR-29a-3p/SPARC axis with associated enhancement of TGF-β/SMAD signaling
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背景：特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种致命性疾病，治疗方法有限。circHIPK3在纤维化肺组织中表达上调，但其在肺上皮细胞中的作用以及与TGF-β/SMAD信号通路的联系尚不清楚。
背景：特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种致命性疾病，治疗方法有限。circHIPK3在纤维化肺组织中表达上调，但其在肺上皮细胞中的作用以及与TGF-β/SMAD信号通路的联系尚不清楚。
方法：研究人员使用了转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激的肺上皮细胞（A549, BEAS-2B）和博来霉素诱导的小鼠模型。通过反义寡核苷酸（ASOs）沉默circHIPK3。利用荧光素酶报告基因和RNA pull-down实验评估直接相互作用，并通过功能干预实验研究提出的调控轴。通过CAGA报告基因检测TGF-β/SMAD活性，通过免疫共沉淀（co-IP）/共定位分析SPARC与TGFBR2的关联。
结果：circHIPK3在TGF-β1处理的上皮细胞和纤维化肺组织中表达上调。沉默circHIPK3可减少上皮重编程、迁移和纤维化标志物。circHIPK3直接结合miR-29a-3p，从而增加SPARC的表达。沉默SPARC的表型与敲低circHIPK3或过表达miR-29a-3p相似。过表达SPARC增强了TGF-β/SMAD信号传导，并与TGFBR2共定位。在体内实验中，阻断miR-29a-3p加剧了纤维化，而这种效应可通过敲低SPARC减弱，这支持了SPARC在miR-29a-3p介导的纤维化反应中的下游作用。
结论：研究人员在实验性肺纤维化中发现了一个驱动促纤维化上皮重编程和增强TGF-β/SMAD信号的circHIPK3/miR-29a-3p/SPARC轴，揭示了一种机制和潜在的治疗靶点。
论文解读
研究背景与科学问题
特发性肺纤维化（IPF）是一种病因不明、进展迅速且致命的间质性肺病，其病理特征为成纤维细胞激活和细胞外基质（ECM）过度沉积，导致肺功能不可逆丧失。现有药物如吡非尼酮和尼达尼布仅能延缓疾病进展，因此亟需新的治疗靶点。转化生长因子-β（TGF-β）是关键的促纤维化细胞因子，能驱动成纤维细胞活化、ECM产生以及促纤维化上皮表型的形成，其特征是上皮重编程和迁移能力增强。
近年来，非编码RNA，尤其是环状RNA（circRNAs），已成为纤维化中基因表达的关键调控因子。其中，circHIPK3在癌症和心脏纤维化中均有报道。虽然已有研究显示circHIPK3可通过成纤维细胞中心机制促进肺纤维化，但它是否在上皮细胞中发挥特异性的促纤维化作用，以及它如何将竞争性内源RNA（ceRNA）调控与TGF-β受体/SMAD通路输出联系起来，仍不清楚。此外，miR-29家族是公认的抗纤维化微小RNA（miRNA），在纤维化组织中持续下调，但其上游调控机制，特别是ceRNA介导的miR-29a-3p活性缓冲机制，在IPF中尚未完全阐明。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）是一种在纤维化肺微环境中富集的基质细胞蛋白，已被证明与增强的TGF-β/SMAD通路活性有关。然而，SPARC是否受circRNA/miRNA轴调控，尤其是在上皮细胞背景下，仍有待探索。
基于此，本研究旨在探究circHIPK3是否通过调节miR-29a-3p的可用性来解除对SPARC的抑制，从而增强TGF-β/SMAD通路输出，进而驱动上皮细胞的促纤维化程序。
主要研究方法与技术
研究人员采用了体外和体内相结合的实验策略。体外实验使用TGF-β1刺激的人肺上皮细胞系（A549和BEAS-2B）。体内实验采用博来霉素（bleomycin）诱导的C57BL/6小鼠肺纤维化模型，设置了正常对照组、模型组及多种干预组（每组5只小鼠）。关键技术包括：
- 1.
基因沉默与过表达：使用靶向circHIPK3剪接位点的反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）以及miRNA模拟物/抑制剂进行功能获得与缺失研究。
- 2.
分子互作验证：通过双荧光素酶报告基因实验和RNA pull-down实验验证circHIPK3与miR-29a-3p的直接结合，以及miR-29a-3p与其靶基因SPARC和胰岛素样生长因子1（IGF1）的结合。
- 3.
信号通路与蛋白互作分析：利用CAGA盒荧光素酶报告基因检测TGF-β/SMAD转录活性；通过免疫共沉淀（co-IP）和免疫荧光共定位分析SPARC与TGFBR2的物理关联。
- 4.
组织学与生化分析：采用苏木精-伊红（HE）染色、Masson三色染色、免疫组化（IHC）和羟脯氨酸含量测定评估肺组织纤维化程度。
主要研究发现
1. 沉默circHIPK3可减弱TGF-β1诱导的肺上皮细胞上皮重编程和细胞迁移
研究人员发现，TGF-β1处理显著上调了circHIPK3的表达，但不影响其线性宿主基因HIPK3 mRNA的水平。使用特异性ASO敲低circHIPK3后，能有效逆转TGF-β1诱导的间充质标志物（波形蛋白Vimentin、N-钙黏蛋白N-cadherin）上调、上皮标志物（E-钙黏蛋白E-cadherin）下调以及细胞迁移能力的增强。
2. circHIPK3直接结合并负调控miR-29a-3p
通过生物信息学预测和实验验证，研究人员发现circHIPK3含有miR-29a-3p的结合位点。双荧光素酶报告基因和RNA pull-down实验证实了两者的直接物理相互作用。TGF-β1处理会抑制miR-29a-3p的表达，而敲低circHIPK3则可显著恢复其表达水平。
3. circHIPK3/miR-29a-3p轴调控TGF-β1诱导的上皮重编程和细胞迁移
联合干预实验表明，单独敲低circHIPK3或过表达miR-29a-3p均可减轻TGF-β1诱导的上皮重编程和细胞迁移，而两者联合处理的效果更为显著。
4. 鉴定SPARC为circHIPK3/miR-29a-3p轴的下游直接靶标，IGF1为次要候选
通过整合miRNA靶点预测和疾病关联分析，研究人员筛选出SPARC和IGF1作为候选基因。双荧光素酶报告基因实验证实miR-29a-3p可直接结合SPARC和IGF1的3‘非翻译区（3’UTR）。功能验证显示，沉默SPARC能更一致且有效地逆转TGF-β1诱导的促纤维化表型，且其效应依赖于miR-29a-3p，而IGF1的作用较弱且不一致。因此，SPARC被确定为该轴的主要效应分子。
5. SPARC通过增强TGF-β/SMAD信号传导并以miR-29a-3p依赖性方式促进纤维化
过表达SPARC可增强TGF-β1诱导的Vimentin、N-cadherin、SNAI1、SNAI2表达以及SMAD2/3的磷酸化水平，并激活TGF-β/SMAD报告基因活性。相反，沉默SPARC则抑制这些变化。重要的是，SPARC的这些促纤维化效应可被miR-29a-3p模拟物或抑制剂所调控。免疫共沉淀和免疫荧光实验显示，SPARC与TGFBR2存在于同一复合物中并在细胞内共定位，提示SPARC可能通过直接与受体相互作用来增强TGF-β信号传导，而非改变总受体蛋白水平。
6. 在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中验证circHIPK3/miR-29a-3p/SPARC轴的体内功能
在体内模型中，研究人员观察到circHIPK3和SPARC表达上调，而miR-29a-3p表达下调。给予antagomiR-29a（miR-29a抑制剂）会加重纤维化，表现为促纤维化蛋白和ECM沉积增加。敲低circHIPK3或SPARC均可减轻纤维化。尤为关键的是，在antagomiR-29a处理的背景下，同时敲低SPARC能够逆转antagomiR-29a加剧的纤维化表型，而在敲低circHIPK3的基础上再敲低SPARC并未显示出额外的抗纤维化效果，这有力地证明了SPARC是该通路中位于miR-29a-3p下游的关键效应分子。
7. 沉默SPARC可减轻antagomiR-29a处理小鼠的纤维化相关组织病理学改变
组织学和IHC定量分析进一步证实，antagomiR-29a加剧了胶原沉积和肺泡结构破坏，而si-SPARC联合治疗可有效逆转这一恶化趋势。这表明SPARC在miR-29a-3p介导的ECM重塑过程中发挥着不可或缺的核心作用。
结论与意义
本研究的结论是，在实验性肺纤维化中，存在一个由circHIPK3/miR-29a-3p/SPARC组成的调控轴，该轴驱动促纤维化的上皮重编程并增强TGF-β/SMAD信号传导。具体而言，TGF-β1上调circHIPK3，后者作为miR-29a-3p的海绵，降低了游离miR-29a-3p的水平，从而解除了对其靶基因SPARC的抑制作用。升高的SPARC通过与TGFBR2相互作用，进一步增强TGF-β/SMAD信号通路，形成一个正反馈环路，最终促进纤维化进展。
这一发现揭示了IPF发病的新分子机制，即一种circRNA可通过不同的miRNA伙伴在不同细胞类型中发挥促纤维化作用，并首次阐明了circHIPK3/miR-29a-3p/SPARC轴在上皮细胞中的关键角色。该研究不仅加深了对IPF复杂病理机制的理解，更重要的是，为开发针对该信号轴的新型抗纤维化疗法提供了潜在的分子靶点，例如通过靶向circHIPK3或SPARC来恢复miR-29a-3p的功能，可能成为治疗IPF的有效策略。
