TBK1过表达减轻ALS/FTD P497S UBQLN2小鼠模型中的神经元丢失

《Neurobiology of Disease》：TBK1 overexpression reduces neuronal loss in the P497S UBQLN2 mouse model of ALS/FTD

　　

摘要专业翻译 TBK1蛋白水平在UBQLN2肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型中降低。TBK1过表达减轻ALS P497S UBQLN2小鼠模型中的神经元丢失。TBK1过表达减轻ALS P497S小鼠模型中的运动神经元丢失。TBK1与UBQLN2直接结合。UBQLN2缺失加速TBK1蛋白周转。

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一、研究背景与研究目的

肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种快速进展的神经退行性疾病，导致运动功能丧失。约50%的ALS患者同时伴有痴呆表现，约70%的患者在确诊后3年内死亡。病理上，该疾病以上运动神经元和下运动神经元的丢失为特征。此外，超过97%的ALS患者出现TDP-43病理改变，表现为TDP-43从细胞核正常高浓度位置清除，常伴随其在细胞质中的移位和聚集。

在病因学方面，已发现超过30个基因的突变与遗传性ALS相关。值得注意的是，其中许多相同的突变也导致额颞叶痴呆（Frontotemporal dementia，FTD），提示ALS和FTD属于同一疾病谱系。在导致ALS/FTD的突变基因中，调控蛋白质稳态（proteostasis）的因子构成了最大类别。本研究聚焦于UBQLN2和TBK1两个基因，二者的突变均可导致ALS和/或FTD，且在蛋白质稳态调控中发挥重要作用。UBQLN2与TBK1可相互结合，提示二者可能协同发挥作用。

UBQLN2突变于2011年首次被发现与ALS/FTD相关。UBQLN蛋白家族是蛋白质稳态的重要调控因子，主要功能是将泛素化蛋白转运至蛋白酶体或自噬体进行降解，还可作为分子伴侣结合并保护多肽中的疏水片段，并参与蛋白质再折叠。对ALS/FTD突变型UBQLN2蛋白的研究发现其大多数上述功能存在缺陷，推测导致蛋白质稳态网络崩溃并引发疾病。

TBK1突变于2015年首次被发现为ALS/FTD的致病基因。大多数TBK1突变导致TBK1蛋白表达丧失，强烈提示TBK1单倍剂量不足驱动ALS发病。TBK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调控干扰素信号和自噬。TBK1完全缺失是致死的，而脑内条件性敲除该基因会诱导严重的自噬缺陷。Chen等人此前发现TBK1可与UBQLN2结合，且ALS突变型UBQLN2蛋白（P497H和P506T）与TBK1的结合强于野生型UBQLN2，这种更强的相互作用以某种方式抑制了IRF3信号。

研究人员此前建立了两种UBQLN2转基因（Tg）ALS/FTD小鼠模型，分别携带P497S和P506T UBQLN2突变。在免疫印迹表征中，研究人员发现终末期疾病小鼠的脊髓裂解液中TBK1水平较同龄非转基因对照显著降低。在SOD1^G93A ALS小鼠模型中也发现了类似的TBK1下降。有趣的是，通过AAV9-Tbk1过表达增加TBK1并未延迟SOD1^G93A小鼠的发病，但将生存期延长了10天。本研究旨在确定TBK1水平降低是否参与P497S UBQLN2转基因系的疾病发病机制，并验证通过TBK1过表达恢复其水平是否能减轻该模型的病理学特征。

二、研究内容与主要结论

研究人员将P497S UBQLN2转基因小鼠与Bac-TBK1转基因小鼠（携带一个额外拷贝的人TBK1基因，受其正常启动子控制）杂交，获得四种基因型后代：非转基因（Non-Tg）、单转基因TBK1、单转基因P497S和双转基因TBK1/P497S。由于当前P497S品系的运动行为表型较原始品系减弱，研究重点集中于52周龄动物中仍可稳定检测到的神经病理学特征，包括海马神经元减少、脊髓运动神经元减少以及脊髓运动神经元中的TDP-43病理。

研究结果表明，TBK1过表达在P497S UBQLN2小鼠中恢复了脑内TBK1水平，防止了运动神经元丢失，减轻了TDP-43病理，并减少了海马CA1区和齿状回区域的神经元丢失。此外，TBK1过表达在雄性双转基因小鼠中减少了UBQLN2包涵体的数量，但在雌性中未见此效应。研究还发现TBK1与UBQLN2直接结合，UBQLN2的缺失加速了TBK1的蛋白周转。这些发现提示，增加TBK1水平或防止其丢失，可能为缓解或延缓UBQLN2突变引起的ALS/FTD提供治疗策略。

三、关键技术与方法

本研究使用了以下主要技术方法：一是转基因小鼠杂交策略，将P497S UBQLN2转基因小鼠与Bac-TBK1转基因小鼠杂交以获得四种基因型，小鼠均来自美国马里兰大学，P497S品系已与C57BL/6J小鼠回交至少10代；二是免疫印迹分析，检测脑和脊髓裂解液中TBK1、UBQLN2、p62、LC3、泛素、IRF3和IRF7等蛋白水平；三是立体学计数，对脊髓运动神经元（甲酚紫染色和ChAT免疫荧光染色）及海马NeuN阳性神经元进行定量；四是免疫荧光染色结合共聚焦显微镜，评估TBK1与UBQLN2的共定位及TDP-43病理；五是GST-pulldown实验，验证TBK1与野生型及5种ALS突变型UBQLN2蛋白的直接结合能力；六是放线菌酮追踪实验，在野生型HeLa细胞和UBQLN2敲除（KO8）细胞中比较TBK1蛋白的周转速率。

四、研究结果

2.1 TBK1与终末期P497S和P506T UBQLN2转基因小鼠脊髓运动神经元中的UBQLN2包涵体共定位

通过双免疫荧光染色，研究人员发现TBK1和UBQLN2的荧光信号在两种突变系运动神经元内的包涵体中呈现良好共定位，而细胞外包涵体的共定位较少。线扫描强度测量确认了两个荧光信号在运动神经元斑点上的良好对齐。这种脊髓中强烈的TBK1染色与免疫印迹检测到的TBK1水平降低形成对比，提示部分TBK1可能重新分布至病变脊髓运动神经元的UBQLN2包涵体中，从而减少了可溶性或功能性TBK1池。

2.2 P497S UBQLN2小鼠中TBK1水平的调控

研究人员将P497S UBQLN2转基因小鼠与Bac-TBK1转基因小鼠杂交，获得四种基因型后代。体重测量显示，单转基因TBK1小鼠的体重增长与Non-Tg组无显著差异；单转基因P497S小鼠体重最低，雌性P497S小鼠在44周龄后与Non-Tg组有显著差异；双转基因TBK1/P497S小鼠的体重略高于单转基因P497S小鼠，在雌性群体中尤为明显。所有小鼠在52周龄时被处死并收集脑和脊髓进行病理检查。

2.3 双转基因P497S/TBK1小鼠中TBK1水平的恢复

免疫印迹分析显示，在脑组织中，雌性单转基因P497S小鼠的TBK1水平较Non-Tg显著降低；单转基因TBK1小鼠脑内TBK1水平升高；双转基因P497S/TBK1小鼠的TBK1水平恢复到与Non-Tg动物大致相同。在脊髓中，TBK1水平在单转基因TBK1小鼠中明显高于Non-Tg，双转基因TBK/P497S小鼠的TBK1水平明显高于单转基因P497S动物，表明遗传策略在脑和脊髓中均成功提高了TBK1表达。

2.4 TBK1转基因过表达减轻P497S UBQLN2小鼠的运动神经元丢失

立体学计数显示，单转基因P497S小鼠的脊髓运动神经元数量较Non-Tg显著减少20%–50%；单转基因TBK1小鼠的运动神经元数量与Non-Tg相似；双转基因P497S/TBK1小鼠的运动神经元数量与Non-Tg无显著差异，强烈表明增加TBK1水平可防止表达P497S转基因动物的运动神经元丢失。TDP-43病理评估显示，单转基因P497S动物中呈现明显TDP-43病理（核清除或胞质移位）的脊髓运动神经元数量显著增加，而双转基因P497S/TBK1小鼠的此类病理显著减少，TDP-43更均匀地集中在细胞核中。

2.5 TBK1过表达减少P497S UBQLN2转基因小鼠的神经元丢失

对海马CA1区和齿状回区域的NeuN阳性神经元进行立体学计数发现，单转基因P497S动物两个区域的神经元数量均较Non-Tg显著减少。单转基因TBK1小鼠在两个区域的神经元数量有轻微但非显著的减少。重要的是，双转基因P497S/TBK1雄性和雌性小鼠在CA1和齿状回区域的神经元数量均高于P497S动物，且与Non-Tg无显著差异，表明TBK1过表达在中枢神经系统多个区域保护神经元免于突变P497S UBQLN2蛋白表达引起的死亡。

2.6 双转基因P497S/TBK1小鼠的神经病理学免疫印迹分析

p62（SQSTM1）水平在单转基因P497S小鼠的脑和脊髓中较Non-Tg显著升高，但双转基因P497S/TBK小鼠的p62水平较单转基因P497S仅轻微降低，未达显著水平。LC3水平在四种基因型间相对不变。单转基因P497S雄性小鼠脑内抗泛素免疫反应性显著增加，该反应性在双转基因雄性组中显著降低，表明TBK1过表达减少了P497S阳性小鼠中泛素化蛋白的积累。IRF3水平在四种基因型间差异不大，IRF7水平在各基因型和性别间存在变异，未在TBK1/P497S小鼠中显示一致的恢复模式。

2.7 双转基因P497S/TBK1雄性（而非雌性）小鼠的UBQLN2聚集体少于单转基因P497S小鼠

在齿状回、CA1和皮层三个脑区中，单转基因P497S小鼠的UBQLN2包涵体数量大幅增加，大多数包涵体p62阳性。双转基因雄性小鼠的UBQLN2包涵体数量较单转基因P497S动物显著减少但未消除，而雌性双转基因小鼠未见聚集体减少。p62共定位未见明显变化。

2.8 P497S小鼠中TBK1蛋白被UBQLN2聚集体螯合

免疫荧光染色显示，在单转基因P497S小鼠的脊髓运动神经元内，UBQLN2包涵体呈TBK1阳性；在双转基因TBK1/P497S小鼠中，脑内更多UBQLN2聚集体呈现TBK1富集。生化分级提取实验表明，32周龄P497S小鼠皮层脑组织的去垢剂和尿素提取后沉淀中，TBK1蛋白与UBQLN2蛋白共沉淀的量约为Non-Tg的1.7倍，沉淀中富含p62和泛素化蛋白。24周龄小鼠中也观察到类似趋势。这些结果支持TBK1被UBQLN2聚集体螯合从而导致其在P497S小鼠中耗竭的观点。

2.9 TBK1与UBQLN2相互作用的免疫沉淀和pulldown分析

内源性免疫共沉淀实验中，TBK1与UBQLN2的共沉淀信号微弱且不确定。在UBQLN2敲除HeLa细胞中过表达野生型或5种ALS突变型UBQLN2蛋白后，TBK1共沉淀同样微弱。GST-pulldown实验证实TBK1与野生型UBQLN2直接结合，结合量比GST对照高50倍。5种ALS突变型UBQLN2中，P497H和P497S突变体与TBK1的结合显著弱于野生型，P509S突变体与TBK1的结合量与野生型相当。

2.10 TBK1的周转受UBQLN2调控

放线菌酮追踪实验显示，UBQLN2敲除（KO8）HeLa细胞中TBK1的周转显著加速，表明UBQLN2可稳定TBK1。在KO8细胞中重新表达野生型UBQLN2蛋白可恢复TBK1稳定性，使其周转速率与野生型HeLa细胞相似。5种ALS突变型UBQLN2蛋白均能以与野生型相似的程度稳定TBK1蛋白，提示ALS突变蛋白在此功能上并无缺陷。

五、讨论与结论

讨论部分指出，TBK1蛋白水平在病变P497S UBQLN2转基因小鼠的脑中降低，而脊髓中变化较小，但在表型更激进的早期品系和P506T品系中观察到显著下降，提示TBK1水平下降与发病机制（特别是运动功能障碍）之间可能存在相关性。TBK1过表达恢复了P497S品系脑内TBK1水平并防止了神经退行性变，其神经保护作用延伸至脊髓，表现为运动神经元丢失和TDP-43病理减轻。

研究人员提出了两种可能且非互斥的机制解释UBQLN2突变如何导致TBK1丢失：其一，突变P497S UBQLN2蛋白沉积形成的聚集体结合并螯合TBK1蛋白，耗竭其胞质游离池；其二，UBQLN2功能丧失导致TBK1去稳定化，因为UBQLN2缺失细胞中TBK1周转加速。研究人员认为TBK1周转加速的可能性较低，因为UBQLN2突变已知会阻碍蛋白质降解。

研究结论为：TBK1水平在UBQLN2 ALS/FTD小鼠模型的易感中枢神经系统组织中降低，通过遗传手段恢复TBK1水平可减轻P497S UBQLN2小鼠的神经元丢失和TDP-43病理。研究支持进一步探索TBK1增强作为预防UBQLN2突变所致疾病的治疗策略。但需注意，TBK1重复与正常眼压性青光眼相关，任何提高TBK1表达的治疗尝试都应谨慎控制。