聚苯乙烯纳米粒子与水溶性柴油组分单独及联合暴露对皱鳃海鞘（Styela plicata）的急性影响：协同性生殖腺组织损伤

《Marine Environmental Research》：Effects of Acute Exposure to Polystyrene Nanoparticles and Water-Soluble Diesel Oil Fraction alone and combined in the ascidian Styela plicata: Synergistic Gonadal Tissue Damage

　　

# 摘要

塑料和石油污染是当今海洋生态系统面临的两大主要威胁之一。它们通过从氧化应激到DNA和组织损伤，直至死亡的毒理学效应，危害海洋生物。海鞘作为活跃的滤食性生物，容易受到悬浮污染物的暴露，也易发生生物富集。本研究首次以环境现实浓度（PS NP 20 nm, 50 μg/L；WFDO 5% FSW）为条件，探讨了聚苯乙烯纳米颗粒（PS NPs）和柴油油水溶组分（WFDO）对褶海鞘（*Styela plicata* Lesueur, 1823）成体的单独和联合短期（48小时）效应。本研究评估了氧化应激生物标志物和组织学改变。未发现乙酰胆碱酯酶活性（AChE）的显著变化，而抗氧化酶过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）的活性显著降低，且两者呈强正相关。综合生物响应指数（IBRv2i）证实了抗氧化系统的扰动。在所有处理组中（无论是单独暴露还是联合暴露），活性氧（ROS）均未观察到变化，这表明CAT和GST活性的降低可能是由污染物与酶的相互作用引起的，而非氧化应激所致。组织学分析显示，单独暴露未引起组织改变，但联合暴露组则出现了显著的结构变化。这种不一致性——生化终点未表现出协同效应，而生殖腺损伤仅在联合组中表现出协同效应——提示两者通过不同的机制发挥作用。这些发现突出了污染物混合带来的生态风险增加。

# 引言

塑料废弃物的广泛存在是一个日益严重的环境问题。自20世纪50年代以来，所有生产的塑料中仅有9%被回收，约50%最终被处置在垃圾填埋场或自然环境中[1]、[2]。在全球海岸线和海洋环流中最常检测到的塑料聚合物之一是聚苯乙烯（PS）[3]、[4]。尺寸约为1至100 nm的纳米塑料，通过较大塑料废弃物的破碎或直接排放自含有纳米塑料的消费产品而进入水环境[5]、[6]、[7]。因此，这种纳米尺度便于被多种水生生物摄取和滞留，从浮游动物到鱼类，从而导致生物富集和毒性效应[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。纳米粒子（NPs）通常可诱导氧化应激，导致DNA损伤和组织病理学异常[13]、[14]、[15]。聚苯乙烯纳米颗粒（PSNPs）已被证明可在藻类、软体动物、虾类和鱼类等多种海洋生物中引起细胞和结构损伤、免疫抑制、氧化应激和炎症反应，尽管这些研究通常在远高于环境现实浓度的水平（>1 mg/L）进行[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。

与此同时，海洋石油泄漏代表了一个普遍的环境挑战[22]。原油中含有多达10,000种不同的烃类化合物，其毒性造成显著的生物损伤，包括死亡率增加、生理功能受损（摄食、生长、繁殖）、鱼类、软体动物（双壳类和有头类）及棘皮动物（海胆和海星）的卵和幼体发育异常、鳃部污染、免疫力降低和DNA损伤[23]。一个关键的环境载体是泄漏后形成的水溶组分（WSFs），它包含通过长期接触和自然风化过程分配进水柱的石油成分[24]。从生态毒理学角度来看，这些溶解组分是最令人担忧的。WSFs主要由低分子量烃类组成，特别是溶解性更强的芳香族化合物，以及少量溶解性较差的高分子量物质[25]。重要的是，正是这种溶解组分，而非乳化或吸附形式的油类，对水生生物构成了最大的毒理学风险[26]。滤食性生物由于处理大量海水而尤其脆弱。研究表明，暴露会在这些物种中引起相当大的生理应激，导致脂溶性毒素的生物富集[27]，并破坏氧化还原稳态，最终通过产生活性氧导致氧化应激[28]。

海鞘在成体和发育阶段均被广泛用作生态毒理学研究的模型，这归因于其若干关键特征[29]、[30]、[31]、[32]。作为脊椎动物的最近亲缘无脊椎动物[33]，其系统发育位置使其在外推毒理学效应方面具有进化上的相关性。此外，作为滤食性生物，它们表现出双重摄取机制：可溶性化合物通过其保护性的被囊层直接渗透，同时通过咽部器官持续泵送和过滤海水，导致环境污染物加速积累[34]、[35]、[36]。

一个新兴的关键担忧是，纳米塑料可能由于高比表面积而充当污染物载体，从而促进吸附的有毒化学物质（如持久性有机污染物）的转移，这些化学物质可被水生生物无意中摄取[37]。此外，它们通过内吞作用进入细胞的能力可能影响通过其他途径的污染物摄取[38]。其疏水性聚合物结构可作为污染物（如多环芳烃）的有效吸附剂，导致很高的塑料-水分配系数[39]、[40]、[41]。特别是，PS NPs已被证明对多环芳烃（PAHs）具有非常高的吸附能力[42]。当被摄取或与生物体接触时，这些载有化学物质的纳米塑料可能增强污染物的摄取和毒性[43]、[44]、[45]。Trevisan等[46]描述了这种"特洛伊木马"效应的体内相关性，表明吸附了PAHs的聚苯乙烯NPs改变了鱼类胚胎中PAHs的组织分布和线粒体毒性，证实联合暴露与单一暴露相比产生了不同的生物学结果。因此，在港口等两种污染物共存的环境中，PS NPs很可能吸附分散油中的烃类，增加污染物的持久性、对海鞘等滤食性生物的生物可利用性以及潜在的毒性影响。然而，这种载体效应对柴油油等复杂、现实污染物混合物的毒理学后果仍知之甚少，需要实验验证。

据我们所知，目前没有关于PS NPs和柴油油水溶组分（WFDO）联合效应于海鞘的信息。因此，本研究旨在评估柴油油水溶组分（5% WFDO）和环境现实浓度的PS NPs（PS NPs; 50 μg/L）对海鞘*Styela plicata*的急性暴露效应，包括单独暴露和联合暴露。为此，我们评估了生化标志物（过氧化氢酶和谷胱甘肽S-转移酶酶活性、总活性氧量和乙酰胆碱酯酶活性）和生殖腺的组织学分析，作为生理应激和组织损伤的综合终点。我们假设PS NPs将作为WFDO衍生烃类的载体[47]，导致比单独暴露于WFDO或PS NPs时更严重的生理紊乱和组织学损伤。

# 材料与方法

## 1. 材料

### 组织学

解剖后，生殖腺立即固定在10%福尔马林中。根据Martoja和Martoja[53]的标准方法，经过冲洗后，组织用逐级递增的酒精（70%、95%和100%）脱水，每级20分钟，每级更换三次溶液。然后石蜡包埋。7 μm厚度的石蜡切片用Masson三色试剂盒（RAL Diagnostics）染色。

该三色方法依次施加对比性……

### 综合生物响应指数第2i版

综合生物响应指数第2i版（IBRv2i）非加权指数被用于简化整体生物响应的解释。该指数提供对生物体健康状况的综合评估。IBRv2i根据Mattos等[55]的方法计算。简而言之，该指数对每个个体，将每个生物标志物与对照组确定的参考值之间的绝对偏差相加。在此意义上，对照组定义正常……

### 统计分析

所有统计分析均使用R软件（版本4.5.2）在RStudio环境版本2026.01.1+403中完成。GraphPad Prism软件（版本8.0.1）用于数据整理。使用Shapiro-Wilk检验评估各组数据的正态性。对于通过正态性检验（P > 0.05）的数据集，应用双因素方差分析（two-way ANOVA），随后进行Tukey多重比较检验。对于不满足正态性假设的数据集……

# 结果

## 1. 死亡率

在暴露期结束时（48小时），所有实验组均未观察到死亡。此外，关于行为方面，所有海鞘均表现出正常行为，没有观察到明显偏离，如异常的身体收缩或对刺激无反应，且入水孔和出水孔均张开。

## 2. 氧化应激标志物

*Styela plicata*内脏中的过氧化氢酶（CAT）活性如图1.a所示。双因素方差分析显示WFDO具有显著的主效应（F (1,28) = 43.98, p < …

# 讨论

水溶性烃类可迅速溶解于水生环境中，而泄漏清理的延迟会增加该溶解组分的浓度，这是水生生物毒性的主要驱动因素[24]、[56]。相比之下，物理颗粒同样构成重大威胁。塑料纳米颗粒的极小尺寸使它们能够穿透生物膜，可能导致细胞损伤并干扰身体功能，其中PS NPs尤其令人担忧……

# 结论

我们的发现突出了在风险评估中，联合暴露于海洋污染物比单一污染物测试作为生态毒理学工具的可靠性更高。虽然在单独和联合暴露中均观察到解毒机制的显著破坏，表现为CAT和GST水平降低。AChE活性和ROS水平保持不变。鉴于缺乏ROS诱导，观察到的酶抑制可能反映了污染物与酶的直接相互作用，而非……

# CRediT作者贡献声明

Safa Melki：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，方法学，调查，形式化分析，数据整理，概念化。Raja Ben Ahmed：撰写——审阅与编辑，监督。Atf Azzouna：撰写——审阅与编辑，监督。Ilaria Corsi：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证，监督，方法学，调查，概念化。

# 利益冲突声明

作者声明没有已知的相互竞争的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

# 数据可用性

数据可根据请求提供。

# 资金来源

本研究未获得公共、商业或非营利部门资助机构的任何专项资助。

# 竞争利益声明

? 作者声明没有已知的相互竞争的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

# 致谢

我们感谢匿名审稿人投入必要的时间和精力审阅本文。我们真诚地感谢所有宝贵的意见和建议，这些意见和建议帮助我们提高了论文的质量。

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