超越血脑屏障：人类化小鼠模型——胶质母细胞瘤研究中缺失的关键环节

《Oncogene》：Beyond the blood-brain barrier: humanised mice, the missing link in glioblastoma research

　　

胶质母细胞瘤（GBM）仍然是神经肿瘤学领域的一项重大挑战，尽管经过数十年的深入研究和治疗进展，其死亡率依然居高不下，这凸显了亟需开发能够更准确再现人类疾病生物学和病理学特征的创新临床前平台。虽然传统动物模型有助于理解GBM生物学和评估治疗效果，但它们无法完全捕捉肿瘤微环境（TME）的全部复杂性和异质性。离体模型（ex vivo models）在此背景下具有一定优势，然而，它们无法模拟活生物体中存在的复杂动态多细胞相互作用，尤其是中枢神经系统特有的关键治疗屏障：血脑屏障（BBB）、血-脑脊液屏障（BCSFB）和血-脑膜屏障（BMB）。针对这些局限，人类化小鼠模型（humanised mouse models）作为一种先进平台应运而生，能够忠实模拟人类GBM的分子、病理和免疫学特征。这些模型能够复制免疫系统与TME之间复杂的体内串扰（crosstalk），同时保留控制药物向脑内递送的相关治疗屏障。越来越多的证据表明，人类化小鼠模型可密切再现人类免疫成分向TME的浸润，从而能够研究与GBM治疗耐药和治疗失败相关的临床相关相互作用。本综述旨在全面、系统地概述当前用于GBM研究的人类化小鼠模型，重点介绍其应用和比较优势。最后，研究人员评估了每种模型相关的机遇与挑战，并讨论了未来方向，以提高GBM临床前研究的转化相关性和预测能力。人类化小鼠模型提供了一个宝贵的转化平台，将人类免疫系统与PDX原位植入相结合。与传统模型和离体模型相比，这些模型能够再现肿瘤细胞与免疫系统之间的复杂串扰、肿瘤异质性、免疫抑制性TME，以及脑特异性屏障（包括BBB、BCSFB和BMB）等复杂的体内相互作用。未来在这些模型中引入人类肠道微生物组，有望进一步提高GBM研究的转化相关性和精准性。图由BioRender.com创建。

**引言**
胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且最致命的原发性脑肿瘤，年发病率约为每10万人3例。尽管研究进展迅速，但预后极差，且被认为无法治愈。免疫疗法虽为GBM带来了希望，但患者反应高度可变，主要归因于GBM的肿瘤微环境（TME）——一种免疫“冷”肿瘤，以髓系细胞为主，肿瘤相关巨噬细胞约占肿瘤质量的30%和免疫细胞的80%；T细胞仅占所有细胞的约0.9%，且常出现功能障碍。GBM微环境还可通过下调1-磷酸鞘氨醇受体-1等方式诱导系统性免疫抑制。标准治疗包括手术切除、放疗和替莫唑胺化疗，但该方案无法诱导持久的免疫激活，放疗和皮质类固醇的使用还会加重免疫抑制。传统小鼠模型无法完全再现TME的复杂性；离体系统缺乏全身性生理相互作用和多细胞动态，尤其是血脑屏障（BBB）穿透等问题。除BBB外，还有血-脑脊液屏障（BCSFB）和血-脑膜屏障（BMB）影响药物递送。此外，肠道微生物组通过肠-脑轴影响GBM生长和替莫唑胺疗效。因此，人类化小鼠模型应运而生——将人类免疫系统成分植入免疫缺陷小鼠，并原位移植人类肿瘤样本，从而在体内系统中模拟肿瘤与人类免疫系统的复杂相互作用。此类模型能高度还原GBM的组织病理学、分子、血管和TME特征，是目前GBM研究中最强大的工具之一。值得注意的是，这些模型仅人源化造血区室，中枢神经系统及BBB、BCSFB、BMB仍为鼠源性，其转化优势在于将人类肿瘤和人类免疫系统置于解剖学合适的小鼠中枢神经系统区室内。

**人类化小鼠模型概述**
人类化小鼠模型的发展始于将人类肿瘤植入无胸腺裸鼠（Foxn1^nu）。关键里程碑是敲除白介素-2受体（IL-2R）共同γ链（IL-2Rγc），导致小鼠自然杀伤（NK）细胞功能丧失。随后将IL-2Rγc敲除与scid突变或Rag1/Rag2敲除结合，产生了NSG、NOG、BRG等下一代免疫缺陷品系。为进一步增强人类免疫植入和髓系分化，通过瞬时表达或靶向敲入引入了多种人类细胞因子，建立了NSG-SGM3、NOG-EXL、MISTRG等品系。GBM研究中使用两种主要人类免疫细胞来源产生三种人类化模型：外周血单个核细胞（PBMCs）来源的Hu-PBL模型、造血干细胞（HSCs）来源的Hu-CD34⁺模型和人类骨髓/肝/胸腺（Hu-BLT）模型。此外，还有人类化微生物组（HUM）小鼠，即小鼠肠道定植人类微生物群，但免疫系统仍为鼠源性。

**Hu-PBL模型：快速的T细胞主导型人源化**
Hu-PBL模型通过静脉、腹腔或脾内注射PBMCs建立，无需预照射或清髓。接种2×10⁷个PBMCs后4周内，人类CD45⁺细胞约占循环白细胞的50%，以CD3⁺ T淋巴细胞为主。主要限制是致死性移植物抗宿主病（GVHD），其严重程度与CD4⁺ T细胞植入相关，治疗观察窗口约为4-6周。为减轻GVHD，已开发出MHC I类和II类基因失活的品系如NSG-MHC-DKO和NOG-dKO。尽管存在挑战，Hu-PBL模型仍是一种经济、快速的方法。

**Hu-CD34⁺模型：多谱系人类免疫重建**
Hu-CD34⁺模型通过静脉、股内或腹腔注射人类CD34⁺ HSCs建立，通常需要亚致死照射预处理。该模型支持多谱系人类造血，可植入先天性和适应性免疫细胞群。但存在人类B细胞多为未成熟CD5⁺ B细胞、T细胞和NK细胞功能部分受损、单核细胞表型不成熟等局限，且建立时间较长。其优点是GVHD罕见。

**Hu-BLT模型：具有胸腺教育的高级免疫重建**
Hu-BLT模型通过将人类CD34⁺ HSCs注射入免疫缺陷小鼠，并在肾包膜下手术植入自体人类胎儿肝和胸腺组织建立。该模型支持多谱系造血和多样化T细胞亚群发育，由于T细胞在移植的人类胸腺组织中成熟，可实现真实的胸腺教育。但该模型需要生存手术，人类胎儿组织获取受限，且GVHD发生率较高。在C57BL/6 Rag2^null IL2rγ^null Cd47^null背景下改良的Hu-BLT小鼠不发生GVHD，适用于长期研究。

**人类化小鼠模型在GBM中的当前应用**
人类化小鼠模型已成为测试和验证多种免疫疗法的宝贵平台，包括抗体、过继细胞疗法、溶瘤病毒、小分子抑制剂和激动剂。第一代免疫检查点抑制剂如抗PD-1/PD-L1、抗CTLA4和抗LAG3已通过人类化模型研究。特别是嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，例如在人类化NOG-EXL小鼠中使用GPNMB导向的CAR-T细胞可同时清除肿瘤细胞和免疫抑制性髓系群体。人类化模型还越来越多地用于联合免疫治疗研究。

**Hu-CD34⁺和Hu-PBL模型的比较评估**
一项近期综合研究在NSG品系中建立了Hu-CD34⁺和Hu-PBL模型。结果显示，两种模型均支持肿瘤生长和组织病理学特征，但Hu-CD34⁺模型在骨髓、脾脏和血液中具有更高数量的hCD45⁺细胞，且B细胞重建更高；Hu-PBL模型主要限于T细胞。在局部TME重建中，两种模型均显示肿瘤内hCD45⁺浸润高于对侧半球，Hu-PBL产生更多CD4⁺ T细胞，而Hu-CD34⁺有更多单核细胞和树突状细胞（DCs）。空间分布分析表明两种模型均能有效再现GBM的免疫抑制特性。另一项研究使用NSG-SGM3和NOG-EXL品系，通过CD34⁺细胞接种并移植耐照射GBM样本，观察到PDX肿瘤内有T细胞、NK细胞和髓系细胞等广泛浸润，且浸润细胞基因表达谱与复发人类GBM密切相关，并表现出肿瘤异质性增加。

**高级人类化模型：Hu-BLT和HLA限制性品系**
一项研究在8-12周龄NSG小鼠中建立Hu-BLT模型，经亚致死照射（2 Gy）后植入胎儿胸腺和肝脏，并静脉注射1×10⁵自体胎儿肝脏来源CD34⁺ HSCs。植入小鼠颅内GBM后，观察到人类免疫细胞浸润，TME以髓系细胞为主，T淋巴细胞成分较少，反映了GBM的免疫抑制性质。另一项研究使用DRAG小鼠（NRG转基因表达人类HLA-DR4），经250 cGy照射后注射CD34⁺ hDR4⁺ HSCs，再植入GBM患者来源肿瘤球细胞。该模型再现了人类GBM的病理特征和免疫细胞群体，抗人PD-1抗体治疗减少了肿瘤浸润的免疫抑制群体，如CD4⁺PD-1⁺和CD8⁺PD-1⁺ T细胞、巨噬细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs），展示了其在免疫治疗评估中的重要价值。

**人类化GBM模型的新兴应用**
在基于白消安的NOG品系Hu-CD34⁺模型中，植入脑肿瘤干细胞（BTSCs）以评估CD133 mRNA负载的DCs疫苗。结果显示CD8⁺和CD4⁺ T细胞同时激活，产生强效持久免疫反应，抑制CD133⁺胶质瘤干细胞增殖并抑制肿瘤生长。一项初步研究通过骨内注射患者来源CD34⁺ HSCs，随后颅内植入患者匹配的GBM类器官至NOG-EXL小鼠，观察到CD45⁺/CD33⁺浸润，可能实现个性化医疗策略。利用正电子发射断层扫描（PET）技术，研究人员在Hu-PBL模型中直接可视化肿瘤浸润人类T细胞，并利用免疫PET定量人类CD4⁺细胞，显示这些模型可监测治疗对人类GBM TME的影响。另一项研究在NSG-SGM3品系中建立Hu-BLT模型，经人类T细胞耗竭抗体处理后，在植入的GBM中确认人类T细胞存在，且检测到CD4⁺和CD8⁺ T细胞，其中CD3⁺和CD4⁺细胞数量增加与免疫抑制性Treg标志物相关。在NOG-dKO Hu-PBL模型中，STAT3抑制剂STX-0119在替莫唑胺耐药U87模型中显示出显著肿瘤生长抑制，伴随肿瘤浸润淋巴细胞和巨噬细胞积累。

**肠道微生物组作为人类化GBM模型的新兴调节因子**
越来越多的证据表明肠道微生物组在GBM发生和进展中起重要作用。通过建立HUM小鼠（将健康人类供体粪便物质移植到无菌小鼠中），颅内植入GL261细胞并给予抗PD-1治疗，发现不同微生物组成的HUM小鼠对治疗反应不同。初步数据显示，两种不同HUM模型对替莫唑胺和抗PD-1也表现出不同反应，且CD8⁺/Treg比例和产生干扰素-γ（IFN-γ）的细胞毒性CD8⁺ T细胞频率存在差异。另一项研究显示，高级别胶质瘤患者来源的肠道微生物可促进小鼠胶质瘤进展，可能通过1-磷酸鞘氨醇机制。此外，肠道微生物组可调节GBM小鼠模型中免疫细胞的存在和基因激活谱，并在GBM生长不同阶段和替莫唑胺治疗期间发生变化。因此，将人类肠道微生物组准确纳入当前人源化方案具有重要意义。

**双重人类化模型：整合人类免疫和微生物组**
双重人类化小鼠模型同时包含人类免疫系统成分和人类微生物组。通常采用顺序方法：先建立人类化免疫系统，再用抗生素清除小鼠天然微生物群，然后移植人类粪便微生物群。在一项研究中，雌性NSG小鼠经照射后植入人类胎儿胸腺和肝脏组织并注射CD34⁺ HSCs，确认人源化后通过饮水给予广谱抗生素（氨苄西林、甲硝唑、新霉素、万古霉素），然后经口灌胃进行人类粪便微生物群移植。16S rRNA基因测序显示，双重人类化小鼠具有类似人类的微生物组特征，并稳定维持14.5周。另一项研究使用无菌NOG小鼠建立双重人类化模型，显示人源化微生物组可促进人类CD3⁺ T细胞的维持和增殖。使用该模型需注意宿主免疫系统可能通过物种特异性免疫选择影响FMT结果，而移植的人类微生物组也会对植入的人类免疫系统产生免疫调节作用。抗生素治疗和移植时机可显著影响植入效率和稳定性。

**基因人源化品系**
基因人源化是通过同源重组、CRISPR/Cas9相关同源重组或ssODN介导的末端连接等方法将人类DNA序列整合到小鼠基因组中。这些策略改善了免疫细胞植入和人类免疫系统重建。例如，表达干细胞因子（SCF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白介素-3（IL-3）的基因工程小鼠可增强人类免疫细胞植入和分化；人促血小板生成素（TPO）敲入的RAG2^?/?γc^?/?小鼠表现出改善的植入和多谱系分化；MISTRG品系敲入四种人类细胞因子（M-CSF、IL-3、GM-CSF和TPO），可支持连续植入多达四代。CRISPR-Cas9技术能够精确编辑单基因座或多重基因，与BAC等大片段人源化方法结合，保留剪接异构体和器官特异性表达模式。CRISPR已成为体细胞GBM建模和体内筛选的重要工具，例如通过删除Trp53、Pten和Nf1等肿瘤抑制基因生成GBM，或与RCAS-TVA系统结合进行细胞类型定向建模，以及通过立体定向注射AAV-CRISPR文库在条件Cas9小鼠中产生肿瘤。但需注意，传统人类化模型和CRISPR GBM模型不同，目前大多数CRISPR功能研究未在免疫人源化平台中进行，未来可将CRISPR基因编辑与人类免疫细胞植入相结合。基因人源化涉及伦理和监管考量，因为人类序列整合入种系并可能遗传给后代，需遵循相关法规和3Rs原则。

**宿主品系选择**
宿主品系的选择是成功建立人类免疫系统和GBM模型的关键。比较研究显示，NSG-SGM3和NOG-EXL是常用的人源化品系，但NSG-SGM3中MHC综合征（白细胞升高、广泛组织病变）更频繁，限制了长期GBM研究。另一分析比较NSG-SGM3、NOG-EXL、NCG和NSG品系，发现NSG-SGM3具有更高水平的人类单核细胞、肥大细胞、T细胞、DCs和巨核细胞，但循环血小板计数低；NOG-EXL表现出相似细胞谱但血小板更不活跃；NSG和NCG的总体人类免疫细胞数量较低。NSG比NOG支持更高水平的人源化，但NOG-EXL的人源化水平高于NSG-SGM3。基于现有数据，NOG-EXL似乎特别适合需要强髓系植入和长期稳定性的研究，但最佳品系选择仍取决于研究具体终点。

**人类化GBM模型的实用设计考虑**
**预处理和照射策略**：建立Hu-CD34⁺和Hu-BLT模型需要亚致死照射以清除小鼠免疫细胞并为人类HSC植入创造龛位。Hu-PBL模型不建议照射，因为照射会促进CD4⁺ T细胞植入并增加GVHD风险。不同品系对照射耐受性不同：Prkdc突变品系（如NSG、NOG）对照射敏感，耐受剂量约70-150 cGy；Rag突变品系（如BRG、BRGS）可耐受约3-3.3 Gy。GBM研究中照射剂量范围为90 cGy至2.5 Gy。携带Kit突变的品系（如NSG-W41、NBSGW）无需预处理照射即可成功植入CD34⁺ HSCs，消除了照射相关毒性。

**细胞来源、剂量和植入后勤**：GBM研究中HSC剂量范围为10⁴至2×10⁵细胞，PBMC剂量通常为10⁷细胞。推荐最佳CD34⁺ HSC剂量为3×10⁴至10⁵细胞；PBMC最低需要5×10⁶细胞，最佳为5-10×10⁶含T细胞的PBMCs。人类化水平与PBMC剂量正相关，GVHD风险也与PBMC剂量相关。不同供体的人源化细胞对免疫检查点抑制剂反应不同，建议每组使用至少两个供体的细胞并随机分配。

**新鲜与冻存人类细胞**：冻存的脐带血HSCs即使保存多年仍保持植入能力，但植入成功率与冻存状态无必然相关。新鲜CD34⁺ HSCs的人源化水平略高。冻存会影响PBMC的数量和活力，尤其是CD4⁺ T细胞，但相同供体的冻存和新鲜PBMC重建效果无显著差异。

**HLA匹配和自体与异体设计**：HLA是抗原呈递的关键蛋白。肿瘤与植入免疫细胞之间的HLA匹配对于诱导肿瘤抗原特异性T细胞反应很重要。多项研究表明，HLA I类和II类基因座的相似性与肿瘤生长抑制相关，但也存在相反结果。自体模型使用来自同一患者的免疫细胞和PDX，可保留HLA限制性抗原特异性T细胞反应，更密切反映亲本肿瘤和治疗反应；异体模型则使用不同供体的免疫细胞。已发表策略具有异质性，从单一位点HLA I类匹配到多位点I/II类匹配，这种差异会影响肿瘤生长和植入。

**人类化模型的局限性及克服策略**
主要局限包括：Hu-CD34⁺模型需要大量细胞；Hu-BLT模型需要人类胎儿组织且难以获取；Hu-CD34⁺和Hu-BLT模型分化时间长；某些人类免疫细胞谱系发育受限；Hu-PBL模型发生GVHD；缺乏物种特异性生长因子和细胞因子；以及人类免疫细胞与小鼠宿主之间的MHC不匹配。克服策略包括：降低PBMC剂量和使用MHC KO品系（如NOG-dKO、NSG-MHC I/II DKO）减少GVHD；使用基因敲入品系增强特定谱系发育，如NOG-EXL、NSG-SGM3、MISTRG增强髓系发育，NSG-Tg(Hu-IL15)、hIL2-NOG增强NK发育，BRGST增强B细胞发育；使用HLA转基因品系（如DRAG、DRAGA、HUMAMICE）解决HLA限制性T细胞发育问题。

**结论与未来方向**
小鼠模型是GBM临床前研究的基石，人类化PDX模型能忠实再现人类GBM的核心免疫学特征、TME以及组织病理学和分子特征，为免疫疗法和个性化治疗的合理设计和临床前评估提供了宝贵平台。目前人类化模型中人类免疫区室已重建，但BBB、BCSFB和BMB仍为鼠源性，但这些屏障可在可接受的水平上被模拟用于临床前药物开发。未来需将人类微生物组整合到人类化模型中，因为微生物组通过三种途径影响GBM TME：微生物代谢产物直接调节TME免疫区室；微生物组组成决定免疫治疗反应；微生物组影响细胞毒性化疗（如替莫唑胺）的疗效。整合人类微生物组将可在单一动物中研究人类免疫区室、人类肿瘤和影响两者的微生物代谢产物环境，并有助于测试饮食、益生菌或FMT干预作为免疫治疗辅助手段。未来应致力于开发下一代整合人类免疫系统和人类化肠道微生物组的人类化模型，以提高GBM治疗反应和耐药机制预测的准确性。