类漆酶纳米酶（LLNs）在食品质量与安全监测中的设计与应用研究进展

《Foods》：Origin-Associated Variation in Volatile Profiles of Commercial Sour Jujube Pulp

　　

漆酶类似纳米酶（LLNs）是一类受天然漆酶启发的功能性纳米材料。由于其优异的催化性能、结构可调性和优异的稳定性，LLNs已成为食品质量与安全监测中颇具前景的工具。本综述建立了一个关键的结构-活性-应用框架，将仿生和结构工程策略与活性位点、电子结构和催化微环境的调控以及最终在食品基质中的分析性能相关联。研究提供了关于LLNs如何与比色、荧光、电化学和多模式传感平台整合的关键见解。此外，特别强调了LLNs在食品质量监测中的应用，包括生物活性标志物的检测、肉制品新鲜度监测、茶叶的真伪和掺假分析以及其他质量相关参数的评估。在食品安全方面，重点强调了真菌毒素、农药和抗生素残留以及食品添加剂的灵敏检测。尽管取得了上述进展，但在阐明催化机制和活性位点结构、建立标准化评估标准以及提高复杂食品基质中的选择性和可靠性方面仍然存在挑战。因此，未来的研究应侧重于合理的活性位点工程、原位机理表征、标准化性能评估，以及将LLNs与多模式、便携式和智能传感技术相结合，以促进实际食品分析。

1. 引言

漆酶（苯二酚：氧气氧化还原酶，EC 1.10.3.2）是一种多铜氧化酶，催化酚类底物的氧化。漆酶构成一个多样化的酶家族，而非单一酶。尽管其多铜活性位点结构通常是保守的，但真菌、细菌、植物和昆虫漆酶之间蛋白质外壳的源依赖性变异可能影响其底物偏好及最适pH和温度范围。在催化过程中，漆酶以分子氧（O₂）作为末端电子受体并将其还原为水，无需外源H₂O₂作为氧化剂。漆酶表现出广泛的底物特异性，可氧化含有羟基、胺基、羧基和甲氧基及其衍生物的各种芳香族化合物。其绿色催化特性及广泛底物特异性使其在传感、食品、生物医学、环境修复等领域具有重要价值。然而，天然漆酶的实际应用常受限于其对环境条件的敏感性、高昂的生产成本以及回收和再利用的困难。

纳米酶（具有内在酶样活性的纳米材料）的出现为开发稳健、可扩展且高效的生物催化替代方案开辟了新途径。其中，类漆酶纳米酶（LLNs）因其能够复制天然漆酶的催化功能，同时提供增强的稳定性、可调活性和易于功能化等特性而引起了广泛关注。自2015年首次报道具有漆酶样活性的含铜碳点（Cu-CDs）以来，LLNs家族迅速扩展至配位聚合物、金属有机框架（MOFs）、单原子纳米酶（SAzymes）和复合纳米材料。与局限于蛋白质支架的天然漆酶相比，LLNs可通过多样的合成和结构调控策略由多种材料构建，赋予其广泛的组成和结构可调性。尽管LLNs可能在稳定性、可重复使用性和规模化制造方面具有优势，但其实际制造成本取决于前体选择、合成复杂性、批次间重现性以及大规模生产的可行性。

目前，关于LLNs的现有综述主要集中于铜基纳米酶及其在环境和生物医学领域的分析应用。然而，专门针对铜基和非铜基LLNs在食品质量与安全保障中应用的系统综述仍然有限。LLNs结合了漆酶样催化活性与纳米材料的优势，包括高结构稳定性、可调催化性能以及调控其活性位点和表面性质的灵活性，使其成为灵敏且稳健的食品质量与安全监测的候选材料。因此，需要一份全面的综述来弥合这一差距，整合现有知识，并为理解LLNs结构、催化性能与食品应用中分析性能之间的关系提供见解。

2. LLNs的设计策略与材料类型

2.1 LLNs的设计策略

LLNs是模拟天然漆酶催化行为的功能纳米材料，同时整合了纳米材料的优势特性，如卓越的稳定性、成本效益、可规模化生产和易于回收。结构上，漆酶活性位点含有四核铜簇，即一个蓝色I型铜（T1Cu）、一个无色II型铜（T2Cu）和两个III型铜（T3Cu）。在催化过程中，底物在T1Cu附近被氧化，电子通过Cys-His通路转移至三核铜簇（TNC），溶解氧在此被还原形成水。基于潜在催化机制，当前LLNs的设计策略可分为两类：生物启发和结构工程。生物启发方法的本质在于模拟天然漆酶活性中心的微环境，如Cu-N配位、TNC和His-Cys电子转移通路。结构工程策略主要采用纳米结构工程和电子结构调控来赋予纳米酶漆酶模拟催化活性。

2.1.1 生物启发设计策略

受天然漆酶结构和功能特征启发，设计LLNs的生物启发策略主要侧重于重构Cu配位环境、模拟多铜催化中心和调控电子转移过程。为模拟天然漆酶的多铜配位环境，研究人员探索了多种仿生配体，包括天然氨基酸、非天然氨基酸、肽和蛋白质，作为铜离子的配位配体构建LLNs。此外，一系列核苷酸和嘧啶衍生物可作为构建LLNs的配位支架。含有咪唑环的小化学分子和某些羧酸也表现出优异的金属配位能力。为实现优异的催化性能或多功能性，已采用双配体策略。为模拟T1Cu位点的Cu-S结构，引入含硫配体以调节Cu⁺/Cu²⁺的比例。为模拟His-Cys电子转移通路，使用His-Cys二肽构建LLNs。总体而言，生物启发策略提供了与天然漆酶更清晰的结构联系，并能够合理调控金属配位和电子转移通路。然而，其性能高度依赖于配体结构、金属与配体比例、组装条件以及所得配位环境的稳定性。

2.1.2 结构工程设计策略

与主要侧重于重构天然漆酶结构和功能特征的生物启发策略不同，结构工程策略主要依赖于合理的结构设计和电子结构调控来优化LLNs的催化性能。缺陷工程，特别是氧空位构建，通过调控配位环境、电子密度和表面吸附来增强类漆酶活性，从而促进分子扩散和电子转移。电子结构工程以d带中心理论为指导，优化催化表面上中间体的吸附强度。杂原子掺杂和异质结构构建是操控电子结构和促进界面电荷转移的有效方法。与生物启发设计策略相比，结构工程设计策略在调控缺陷、电子结构和界面电荷转移方面提供了更大的灵活性，且无需复制天然漆酶结构即可实现高催化活性。然而，多种缺陷、金属价态和异质表面位点的共存常使真正催化中心的识别复杂化。

2.2 基于结构特征的材料类型

基于结构特征，已报道的LLNs可分为四大类：配位型、MOF基、单原子基和金属氧化物基LLNs。配位型LLNs利用小分子配体和生物大分子配体与金属离子配位构建，通过自组装调控配位微环境。MOF基LLNs以金属节点为内在催化位点，有机连接体可被选择或功能化以促进底物吸附并创造类漆酶微环境。单原子基LLNs在合适的载体上具有原子级分散的金属位点，提供明确的几何结构和可调的电子性质，金属原子通常锚定在氮掺杂碳载体上形成M-N_x位点。金属氧化物基LLNs通过固有性质、丰富表面化学和混合价态阳离子促进电子转移和氧活化。这四类材料各有优势和局限，材料选择应基于目标分析物、食品基质、所需选择性、制备重现性和预期传感形式。

3. 基于LLNs的传感模式

3.1 比色模式传感

比色传感基于有色物质吸收特性的测量，是LLN检测策略中最早且最成熟的模式。LLN启用的比色传感通常采用基于2,4-二氯苯酚（2,4-DP）和4-氨基安替比林（4-AP）氧化偶联的显色系统，形成在510 nm处具有特征吸收峰的红色醌亚胺染料。基于LLN的比色传感因其简单、快速响应、低成本和与便携式及高通量分析的兼容性而被广泛用于检测各种目标物。

3.2 荧光模式传感

与比色检测相比，荧光检测在复杂生物和食品基质中通常表现出更高的灵敏度和准确性。基于LLN的传感策略涉及催化和荧光信号转换，为复杂食品样品的高灵敏检测提供了有效平台。荧光传感通常依赖于非荧光底物邻苯二胺（OPD）氧化为2,3-二氨基吩嗪（DAP），其在约560 nm处发射荧光，生成的DAP可通过荧光内滤效应（IFE）猝灭纳米酶的荧光，实现比率荧光信号输出。

3.3 电化学模式传感

电化学模式传感以高灵敏度、强可靠性和成本效益为特征。采用LLNs的电化学传感基于供电子分析物的催化氧化，将其化学氧化转化为可量化的电信号。LLNs可直接锚定在玻碳电极表面，通过循环伏安法（CV）、差分脉冲伏安法（DPV）、电化学阻抗谱（ESI）和方波伏安法（SWV）等技术获得可测量的电化学响应。

3.4 传感器阵列模式

传感器阵列基于多个传感单元与目标分析物之间的差异交叉反应原理，结合模式识别算法生成独特的多维指纹图谱，即使在复杂基质环境中也能实现可靠的定性和半定量分析。基于单个LLN的多酶活性或多个LLNs的交叉响应已开发出用于分析物选择性识别的传感器阵列平台。为提高传感器灵敏度和检测性能，统计方法和机器学习算法与传感器阵列相结合，包括人工神经网络、层次聚类分析、K最近邻、线性判别分析、随机森林、主成分分析、支持向量机等。

3.5 双/多模式

与单一检测模式相比，双或多模式的整合用于开发多读数分析策略具有显著优势，表现为增强的特异性、可靠性、适用性和低检测限。双模式传感系统通过两种模式的交叉验证建立对环境影响的固有校正，实现更高的分析准确性。纳米酶催化还可与表面增强拉曼散射（SERS）集成，开发高灵敏度传感平台。

4. LLNs在食品质量与安全传感中的应用

4.1 食品质量

4.1.1 生物活性化合物的检测

食品基质是多种生物活性成分的丰富来源，包括酚类化合物、黄酮类、绿原酸、白藜芦醇、槲皮素和抗坏血酸等。基于不同LLNs对酚类化合物的差异类漆酶活性，已构建多种比色传感器阵列，结合机器学习算法和智能手机成像分析，实现了咖啡、茶、洋葱和番石榴等复杂食品基质中多种酚类化合物的高灵敏识别。对于黄酮类化合物，基于LLNs的纳米酶传感器阵列结合机器学习算法已在复杂健康茶中实现五种黄酮的准确判别和预测。利用纳米酶的类漆酶活性，也已建立抗坏血酸定量检测的比色测定法。

4.1.2 感官缺陷物质

苹果汁和橙汁中高水平的愈创木酚会导致异味。基于CuN₄-G修饰的电化学传感器实现了5至50,000 pM范围内愈创木酚的检测，检测限为1.2 pM，并成功应用于贮藏期间被酸土脂环酸芽孢杆菌污染的橙汁检测。此外，LLNs已被广泛用于果汁澄清处理，有效降低酚类含量和浊度。

4.1.3 食品新鲜度分类与预测

贮藏期间食品因微生物代谢和氧化反应会产生挥发性腐败标志物。基于纳米酶的传感平台已进一步推进肉类新鲜度的快速检测。利用介质阻挡放电等离子体方法制备的MnZn双金属冷适应纳米酶可用于挥发性硫化合物的原位监测和肉类新鲜度评估。

4.1.4 茶叶分类及掺假/真伪鉴别

传感器阵列已被广泛用于复杂风味成分或标志物的识别。通过利用LLNs的差异响应及金属离子对其催化活性的调节作用，已开发出3通道比色阵列，实现对不同产地盲茶样品的准确识别。基于两种LLNs催化的茶多酚与4-AP之间的不同颜色反应，结合随机森林算法，该方法实现了茶叶掺假的完美鉴别。

4.2 食品安全

4.2.1 真菌毒素检测与消减

利用目标真菌毒素对LLN类漆酶活性的特异性抑制或增强作用，已建立多种比色传感器用于伏马菌素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的检测。此外，LLNs在真菌毒素的催化转化方面显示出巨大潜力。铁基单原子纳米酶可将黄曲霉毒素B1（AFB1）催化为毒性较低的黄曲霉毒素Q1，铜基LLN对AFB1表现出高氧化能力，基于密度泛函理论计算和液相色谱-质谱联用结果提出了三种降解途径。

4.2.2 农药残留

LLNs在农药检测中通常采用五种机制：(1) LLN活性调节（抑制或刺激）；(2) AChE介导的识别和LLN活性调节；(3) 适配体识别和LLN活性调节；(4) 纳米酶联免疫吸附测定（NLISA）；(5) 多酶级联催化。多种LLNs已被开发用于农药检测，基于目标分析物暴露后其活性被调节的原理。适配体调控的比色生物传感器利用特定适配体优先结合目标农药并增强Ag基LLNs的类漆酶活性，实现了对马拉硫磷、高效氯氟氰菊酯和啶虫脒的高选择性检测。NLISA采用LLN替代天然酶，与传统ELISA相比灵敏度提高了150倍。

4.2.3 抗生素残留检测与消除

基于抗生素对LLN酶活性的抑制作用，已建立多种比色传感器阵列用于多种抗生素的同时检测和判别。通过组氨酸工程增强Cu-BTC纳米酶的类漆酶活性，结合机器学习，构建了基于动力学的纳米酶传感器阵列，用于判别九种β-内酰胺类抗生素，在蜂蜜样品中准确率达95.92%。在抗生素消除方面，两种基于Ce⁴⁺/Ce³⁺的LLNs通过非自由基电子转移机制对多种四环素类抗生素表现出优异的降解率。

4.2.4 食品添加剂

硫化物广泛用作食品防腐剂和风味调节剂。LLN通过Cu-S键形成表现出硫化物增强的活性，增强程度与S^2-浓度呈线性相关，基于此建立了多种食品基质中硫化物的选择性比色检测方法。对于(+)-儿茶素和百里酚等抗菌性食品添加剂，也已建立了基于独特LLNs的比色传感策略。

4.2.5 其他危害性分析物

氨基甲酸乙酯（EC）是酒精饮料和发酵食品中常见产生的含氮毒性化合物。为提高LLNs对EC的选择性，采用了适配体和分子印迹聚合物等识别元件，开发出便携式比色纸基传感器和分子印迹可切换LLN双模式自校准检测方法。在食品过敏原和生物胺检测方面，漆酶模拟物已被用作纳米ELISA中的催化标记物。基于纳米酶活性调节机制，已构建用于精胺和组胺检测的比色传感器。对于双酚A的检测，已制备多种具有增强类漆酶活性的LLNs，并集成智能手机逻辑门测定实现快速定量。

5. 结论与展望

LLNs因其稳健性、成本效益、结构可调性、卓越灵敏度及与多种检测模式的兼容性，在食品质量与安全监测方面具有巨大前景。通过生物启发和结构工程策略，已利用配位工程、金属基纳米材料和杂化功能纳米结构构建了多种LLNs。然而，在活性位点结构和催化路径的直接实验证据、标准化催化评估协议的建立、批次间重现性、长期储存稳定性、基质特异性验证等方面仍存在未解决的基本问题。未来的研究应优先考虑催化效率、选择性和特异性的提升，推进多酶级联系统和多模式检测平台与智能手机读数相结合，开发可持续和可规模化的合成路线，整合计算建模和机器学习，并全面评估毒性和生物相容性。跨学科合作对于将这些先进的LLN基系统从实验室创新转化为实际可部署的解决方案至关重要。