《International Journal of Molecular Sciences》：Biomarker Detection of Lung Cancers Before Clinical Symptoms or the Use of Traditional Imaging Methods in the ITALUNG Trial
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ITALUNG试验（意大利肺癌筛查试验）是一项随机对照试验，评估了低剂量计算机断层扫描（Low-Dose Computed Tomography，LDCT）对超过3100名年龄55–69岁的高危吸烟者及既往吸烟者进行肺癌筛查的有效性。ITALUNG试验由佛罗伦
ITALUNG试验（意大利肺癌筛查试验）是一项随机对照试验，评估了低剂量计算机断层扫描（Low-Dose Computed Tomography，LDCT）对超过3100名年龄55–69岁的高危吸烟者及既往吸烟者进行肺癌筛查的有效性。ITALUNG试验由佛罗伦萨癌症预防研究所协调，并在托斯卡纳地区的三个主要筛查中心（佛罗伦萨、比萨和皮斯托亚）开展。ITALUNG研究显示，筛查组的长期肺癌（Lung Cancer，LC）和心血管死亡率较低，且在女性中观察到显著获益。当对接受肺癌筛查的无症状高危受试者的血液和痰液样本中ITALUNG生物标志物组合的性能进行分析时，即杂合性缺失和微卫星不稳定性（Loss of Heterozygosity/Microsatellite Instability，LOH/MSI）以及循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA），基线筛查的敏感性（Sensitivity，SE）为90%。然而，LDCT筛查和液体生物标志物在肺癌筛查中各自的作用尚未确立，这凸显了生物标志物不仅需要在诊断时，还需要在诊断前样本中检测肿瘤的能力。因此，研究人员评估了ITALUNG生物标志物组合及其单一成分在ITALUNG中识别肺癌患者的纵向性能变化。该队列由55例肺癌患者组成，其生物样本在诊断前数年采集。在接近诊断时采集的检测样本中获得了良好结果：21例肺癌病例中，20例在ITALUNG生物标志物组合检测中呈阳性[95% SE；95% C.I. 0.86–1.04]，18例为LOH/MSI阳性（86% SE；95% C.I. 0.71–1.01），17例为cfDNA阳性（85% SE；95% C.I. 0.70–1.00）。通过分析诊断前3年内采集的样本，该生物标志物组合能够识别超过80%的肺癌病例：6例肺癌患者中，5例在ITALUNG生物标志物组合检测中呈阳性（83% SE；95% C.I. 0.53–1.13）。此外，当在诊断前11年内获取生物标志物检测样本时，超过67%的早期及可切除癌症病例被多种生物标志物组合检出。使用诊断前数年获取的样本时，ITALUNG生物标志物组合的阳性可能既与致癌场效应有关，也与早期肿瘤存在有关。
肺癌是全球癌症死亡的首要原因，低剂量计算机断层扫描（Low-Dose Computed Tomography，LDCT）虽可降低肺癌（Lung Cancer，LC）死亡率，但LDCT筛查与分子生物标志物在肺癌筛查和预防策略中的各自作用尚未确立。通常的批评观点认为，分子生物标志物虽能在诊断时区分有症状肺癌病例与对照，却无法在诊断前样本中实现该区分。因此，研究人员基于ITALUNG随机对照试验，利用其生物样本库中55例肺癌患者的纵向样本，评估ITALUNG生物标志物组合（杂合性缺失和微卫星不稳定性[LOH/MSI]及循环游离DNA[cfDNA]）及其单一成分在诊断前不同时间点识别肺癌的性能变化。结果显示，在诊断前1年内采集的样本中，组合检测敏感性达95%（21例中20例阳性），且优于任一单一成分；诊断前3年内样本仍能识别超过80%的肺癌病例；诊断前11年内样本可检出超过67%的早期可切除癌症。这表明该组合可能反映致癌场效应和早期肿瘤存在，为在临床症状或传统影像学方法出现前进行肺癌早期检测提供了潜在工具，有望用于风险分层和筛查策略优化。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：从ITALUNG试验队列（意大利托斯卡纳地区佛罗伦萨、比萨和皮斯托亚三个中心，共1406例无症状高危受试者接受基线筛查，其中1356例提供血液和痰液样本）中选取55例后续确诊为肺癌的患者，将其生物样本按诊断前取样时间分组。使用定量实时PCR（qRT-PCR）检测血浆cfDNA水平，以3.15 ng/mL为阳性阈值；采用先前验证的方法分析血浆和痰液中的LOH/MSI，任一生物样本阳性即判定该成分阳性。按检测方式、分期、手术可切除性和组织学进行分层，采用标准描述性统计计算敏感性（SE = TP/(TP+FN)）。
### 2.1. 患者特征
在11年随访结束时，主动筛查组共发生91例LC，其中55例此前已接受生物标志物状态分析。该55例中，36例为筛查检出LC，19例为末次筛查LDCT检查后临床出现的癌症或间隔癌。
### 2.2. 按取样至肺癌诊断时间的生物标志物组合及其成分的性能
将取样至诊断时间分为[0–1年]、[1–2年]、[2–3年]、[3–7年]和[7–11年]五个时间窗。最佳性能出现在诊断前1年内采集的标本：21例中20例组合检测阳性（95% SE；95% C.I. 0.86–1.04），18例LOH/MSI阳性（86%），17例cfDNA阳性（85%），组合敏感性高于单一成分。诊断前3年内样本检测仍可识别超过80%的LC病例。
### 2.3. 按检测方式和肿瘤特征的生物标志物组合性能
按癌症分期和肿瘤可切除性分层，基线筛查检出的LC患者中超过83%检测阳性，而重复筛查轮次检出及间隔癌/试验后癌亚组的估计值较低。按诊断时组织学检查，该组合对腺癌的检出率超过71%。
### 2.4. 按取样至肺癌诊断时间分层检测方式和肿瘤特征的生物标志物组合性能
考虑检测方式时，在诊断前1年内采集标本，超过95%的筛查检出及间隔/试验后LC病例被识别：20例筛查检出LC中19例阳性（95% SE；95% C.I. 0.85–1.05）。早期可切除癌症检出率为100%（95% C.I. 1.00–1.00），晚期不可切除癌症为88%（95% C.I. 0.65–1.11），腺癌和鳞状细胞癌均为100%。诊断前3年内，超过83%的筛查检出及早期切除癌症呈阳性。
讨论部分指出，长期随访数据显示LDCT筛查可降低LC和总体死亡率，女性获益更显著；将生物标志物与LDCT结合的多模式筛查可提高特异性。然而，目前尚无高效分子生物标志物进入临床实践，典型批评是生物标志物无法在诊断前样本中区分LC病例与对照。本研究证明ITALUNG生物标志物组合在诊断前样本（包括诊断前3至11年）中仍具较高敏感性，其阳性可能反映吸烟相关的非特异性气道损伤和肿瘤特异性改变，也可能与致癌场效应及基线癌症风险相关。该组合敏感性高于LDCT（文献汇总范围为59%–100%），且cfDNA阈值3.15 ng/mL来自近期区分良恶性肺结节的研究。局限性包括未调整吸烟强度、慢性阻塞性肺疾病、年龄、性别和合并症等混杂因素，多个亚组样本量很小，且分析技术基于研究启动时的平台。未来计划利用现代高通量测序和分子核型分析平台进行再验证。
### 5. 结论
使用临床症状出现或传统影像学方法应用前不同时间点获取的诊断前样本时，ITALUNG生物标志物组合的阳性可能既反映致癌场效应，也反映早期肿瘤存在。尽管前景可观，但将多种分子生物标志物用于LC早期诊断的筛查和标准治疗场景以及肺结节管理仍为时过早。在确定整合生物标志物与LDCT的多模式筛查方法可能改善筛查项目之前，尚需外部验证、更大样本量、特异性及阳性预测值等其他参数，并与现有其他生物标志物进行比较。目前，研究人员建议在未来的研究中利用现有筛查数据集进行验证，可考虑前瞻性入组。一种策略是在更大规模的LDCT筛查队列中进行验证研究；另一种策略是探索该多种生物标志物组合在指导不确定肺结节患者管理及通过整合人工智能与分子生物标志物方法区分良恶性结节方面的潜力。
