真菌细胞外囊泡重塑鼠李糖乳杆菌囊泡以增强溶酶体稳态并缓解肠道炎症

《Gut Microbes》：Fungal extracellular vesicles reshape Lactobacillus rhamnosus vesicles to enhance lysosomal homeostasis and resolve intestinal inflammation

　　

研究人员利用界定化体外 conditioning 系统发现，真菌来源细胞外囊泡(EV)可重编程肠道微生物的囊泡生成与生物活性。裂褶菌(Schizophyllum commune)来源 EV（ScEV）暴露改变了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的 EV 产出，形成 ScEV-conditioned L. rhamnosus EVs（ScEV-LrEVs）。比较蛋白质组学与脂质组学显示囊泡 cargo 广泛重塑，其中羟基化神经酰胺 Cer(t18:0/24:0(2OH)) 在 ScEV-LrEVs 中约富集 60 倍。功能上，ScEV-LrEVs 在 LPS 刺激的巨噬细胞(macrophage)中增强抗炎活性，并改善溶酶体(lysosome)功能，伴随 mTOR-TFEB 相关溶酶体-自噬(lysosome-autophagy)标志物协调变化。在 DSS 诱导结肠炎(colitis)模型中，ScEV-LrEVs 减轻黏膜损伤、减少免疫细胞浸润并增强上皮屏障完整性，同时恢复溶酶体功能及 mTOR-TFEB 相关标志物。神经酰胺富集 EV 部分重现 ScEV-LrEVs 的抗炎与溶酶体恢复活性。上述结果揭示一条跨王国囊泡通讯轴：真菌 EV 暴露重塑肠道微生物囊泡的分子与功能特性，增强溶酶体稳态并对抗肠道炎症。

研究背景方面，细胞外囊泡（EV，extracellular vesicles）已成为跨界生物王国之间的重要通讯介质，可调控免疫、代谢与微生物生态。哺乳动物 EV 研究较充分，而植物与真菌来源 EV 虽可携带酶、脂质和小 RNA 并影响微生物或宿主生理，但真菌 EV 在塑造肠道菌群生态与宿主反应中的作用仍不清楚。肠道微生物 EV 是细菌与宿主交流的关键界面，可调节免疫、维持上皮稳态和控制炎症；益生菌 EV 也能再现亲本菌的益处。已有证据表明植物或真菌来源 EV 可进入胃肠道并改变细菌代谢、群落结构和细菌产物活性，但外源 EV 能否重编程肠道微生物的囊泡生成与生物活性，以及相关机制仍属空白。溶酶体-自噬（lysosome-autophagy）与肠道炎症稳态密切相关，溶酶体功能异常会导致清除障碍与持续炎症，但微生物 EV 直接调控溶酶体功能的证据有限。因此，研究人员开展本研究，以探明真菌 EV 是否及如何改变细菌囊泡生成并影响宿主炎症响应。

研究人员从食用丝状真菌裂褶菌（Schizophyllum commune）分离 EV（ScEV），通过体内示踪与体外共培养发现 ScEV 可被界定化肠道微生物摄取并选择性关联特定菌群；短期与长期暴露实验将鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）鉴定为主要响应菌。多组学分析显示，ScEV conditioning 后的 L. rhamnosus EV（ScEV-LrEVs）在蛋白质组和脂质组上广泛重塑，尤其富含羟基化鞘脂，如 Cer(t18:0/24:0(2OH))。功能实验表明，ScEV-LrEVs 在 LPS 刺激巨噬细胞与 DSS 诱导小鼠结肠炎模型中均表现出强于天然 LrEVs 的抗炎、恢复溶酶体功能、修复上皮屏障作用。研究人员由此得出结论：真菌 EV 暴露可通过跨王国囊泡通讯重塑细菌 EV 的分子与功能属性，进而增强溶酶体稳态并保护肠道抗炎。该论文发表于《Gut Microbes》，其意义在于把“外源真菌 EV—肠道菌群—细菌 EV—宿主免疫”连成可实验界定的机制链条，为食物或真菌囊泡调控肠炎等提供新思路。

主要关键技术方法方面，研究人员使用人粪便样本体外孵育与 FACS 分选结合 16S rRNA 基因测序分析 ScEV 与菌群关联；以健康小鼠进行 PKH26/DiR 标记 ScEV 体内生物分布与短期细菌关联分析，并以 30 天口服 ScEV 评估长期菌群组成变化；采用 ScEV conditioning 后洗涤再培养的体外流程制备 ScEV-LrEVs；以 RAW264.7 巨噬细胞 LPS 模型评估抗炎与溶酶体响应；以 3% DSS 小鼠结肠炎模型评估体内保护效应；并开展比较蛋白质组学、脂质组学、qRT-PCR、Western blot、免疫荧光与免疫组化分析；另用 Cer(t18:0/24:0(2OH)) 重装载 LrEVs 进行功能回补。

研究结果部分，2.1 节 Characterization and biodistribution of ScEVs：研究人员通过差速离心与蔗糖密度梯度超离分离 ScEV，经 DLS、NTA、TEM 与 zeta potential 鉴定为纳米级杯状囊泡；脂质组显示其为甘油酯、鞘脂和磷脂混合组成；DiR 标记口服示踪表明 ScEV 在胃小肠早现、盲肠结肠迟现并可部分入肝，证明口服 ScEV 具备肠道可及性。

2.2 节 ScEVs associate with defined gut bacteria and increase net EV output from Lactobacillus cultures：体外粪便孵育、体内 3 小时灌胃与 30 天给药均显示 ScEV 关联 Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae 与 Lactobacillaceae 等菌群，长期给药后 Lactobacillaceae 相对丰度升高；L. rhamnosus 与 L. reuteri 经 ScEV 处理后生长加快， conditioning 后洗涤再培养使 L. rhamnosus EV 粒子浓度显著增加，说明 ScEV 关联多菌群且促进乳酸杆菌净 EV 产出。

2.3 节 ScEV-conditioned bacterial vesicles enhance anti-inflammatory responses associated with restoration of lysosomal function：RAW264.7 细胞中，ScEV-LrEVs 比 LrEVs 更强抑制 NO、IL-6、TNF-α 等促炎因子并提升 IL-10；LysoTracker 显示其更好恢复 LPS 损伤的溶酶体活性，氯喹（CQ）可削弱该效应；qRT-PCR 与 Western blot 显示 mTOR 下调、TFEB 上调，p62 下降，LC3B、LAMP1、LAMP2 上升，表明 ScEV conditioning 增强乳酸杆菌 EV 的抗炎与溶酶体-自噬协调响应。

2.4 节 ScEV-conditioned Lactobacillus vesicles alleviate colitis and restore epithelial barrier integrity：DSS 结肠炎小鼠中，ScEV-LrEVs 减轻体重下降与疾病活动指数（DAI），恢复结肠长度、减少脾肥大与黏膜侵蚀，降低 TNF-α、IL-6、IL-1β 并升高 IL-10；免疫组化显示 Ly6G⁺ 中性粒细胞与 F4/80⁺ 巨噬细胞浸润减少；ZO-1、Occludin、Claudin-1 等紧密连接蛋白恢复，说明 ScEV-LrEVs 缓解结肠炎并修复屏障。

2.5 节 ScEV-conditioned Lactobacillus vesicles are associated with restoration of lysosomal function in colonic tissues：体内结肠组织分析显示 DSS 使 mTOR 与 p62 升高、TFEB、LC3B、LAMP1、LAMP2 受抑；ScEV-LrEVs 较 LrEVs 更明显恢复 TFEB 信号及上述分子谱，说明细胞水平看到的溶酶体-自噬恢复在结肠组织中被重现。

2.6 节 ScEV-conditioned Lactobacillus vesicles exhibit proteomic and lipidomic remodeling associated with anti-inflammatory activity：蛋白质组显示 ScEV-LrEVs 蛋白数更精简，功能偏向脂质/碳水化合物代谢、蛋白水解与膜转运；脂质组显示鞘脂（SP）与甘油磷脂（GP）扩展，Cer(t18:0/24:0(2OH)) 约 60 倍、Cer(d18:1/24:0(2OH)) 约 40 倍富集，KEGG 富集于鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、磷脂酰肌醇信号与自噬相关通路，表明 ScEV conditioning 带来膜与信号脂质的协同重塑。

2.7 节 Cer(t18:0/24:0(2OH)) reconstitution partially recapitulates the lysosome-restorative and anti-inflammatory activity of ScEV-LrEVs：研究人员将 Cer(t18:0/24:0(2OH))（C24）装载入 LrEVs，C24-LrEVs 在巨噬细胞中剂量依赖地抑制促炎因子、恢复 TFEB、降低 p62 并上调 LAMP1/LAMP2，但未完全等同 ScEV-LrEVs，说明羟基化神经酰胺是重要贡献脂质而非唯一介质。

讨论部分总结：研究人员指出，该研究建立 ScEV conditioning L. rhamnosus 的跨王国囊泡模型，显示外源真菌 EV 可改变细菌 EV 产量、cargo 与功能；但 ScEV 与细菌互作的分子决定因素、其他 Lactobacillus 菌种/菌株是否保守、EV 产量增加来自生物量还是单位细胞释出均未完全厘清。脂质来源可能是真菌脂质直接转移，也可能是 ScEV 诱导细菌代谢重编程，二者不互斥。C24 回补仅为增益功能验证，不能证明其为必需介质；BMP、鞘氨醇相关脂质等可能协同参与溶酶体稳态。体内实验比较 LrEVs 与 ScEV-LrEVs 而未设 ScEV 单独组，因此不能分隔 ScEV 直接作用于宿主与经细菌 EV 间接作用两条路径。健康鼠生物分布也不能直接外推至炎症肠腔；体内是否产生足够且具功能的 ScEV-LrEVs 仍缺特异性标记定量。因果上，mTOR-TFEB 轴尚需 TFEB 敲低/抑制或 mTOR 活化等实验验证。

结论部分翻译：本研究建立一个体外跨王国囊泡 conditioning 模型，其中真菌细胞外囊泡（EV）暴露改变乳酸杆菌来源 EV 的分子与功能特性。ScEV 暴露引起细菌 EV 蛋白质组与脂质组的广泛重塑，尤其是羟基化神经酰胺富集。这些改变与两种不互斥的可能一致：ScEV 相关真菌脂质或脂质中间体直接转移，以及受体菌内 ScEV 诱导的代谢重塑；本实验不能区分这些机制。功能上，ScEV-conditioned Lactobacillus vesicles（ScEV-LrEVs）表现出更优抗炎效力，在体外与体内均抑制 TNF-α、IL-6 与 IL-1β 并增强 IL-10 产生。在 DSS 诱导结肠炎模型中，ScEV-LrEVs 缓解黏膜损伤并恢复上皮完整性，这些保护效应伴随溶酶体稳态改善及 mTOR-TFEB 相关分子标志物协调变化。总之，这些发现提示真菌 EV 暴露可通过涉及脂质转移和/或细菌代谢响应的跨王国互作改变微生物囊泡 cargo 组成，从而促成宿主免疫稳态。该工作拓展了对微生物协作的理解，表明肠道微生物间适应性重塑可通过囊泡驱动生化交换发生；未来研究应鉴定该跨微生物通讯的关键脂质与蛋白质介质，并确定饮食或环境因素如何调节肠道生态系统中的这些囊泡互作。